Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה וההפיכה של E. coli DH5α מוסמך באמצעות הסתגלות של הליך סידן כלורי (12).
1. הגדרת
<ol><li>
ציוד
	<ul>
<li>ספקטרופוטומטר</li>
		<li>צנטריפוגה סורבה (או שווה ערך)</li>
		<li>צנטריפוגה על הספסל</li>
		<li>בלוק חום או אמבט מים</li>
		<li>שייקר מסלולית</li>
		<li>חממה נייחת</li>
		<li>מגש יציקת ג'ל</li>
		<li>ובכן מסרקים</li>
		<li>מקור מתח</li>
		<li>קופסת ג'ל</li>
		<li>מקור אור UV</li>
		<li>מיקרוגל</li>
	</ul>
</li>
	<li>
פתרונות ותגמולים
	<ul>
<li>ציר לוריא-ברטאני (LB) (10 גר' קזאין אנזימי הידרוליזאט, 5 גר' תמצית שמרים ו-5 גר' נתרן כלורי ב-1,000 מ"ל של H2O)</li>
		<li>מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC): (2% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 מ"מ MgSO4,ו 20 mM גלוקוז)</li>
		<li>פתרון CaCl2-MgCl2 (80 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ CaCl2).</li>
		<li>פתרון M CaCl2 (אם תאים ישתנו באופן מיידי) או פתרון 0.1M CaCl2 המכיל 10% (v/v) גליסול (אם תאים יוקפאו לשימוש עתידי).</li>
		<li>לוחות אגר LB</li>
		<li>לוחות סלקטיביים אגר LB (לניסוי זה, מאז plasmid בשימוש מעניק עמידות אמפיצלין, לוחות אגר LB המכיל אמפיצלין 100 מיקרוגרם / mL שימשו)</li>
		<li>
אי קולי זן DH5α</li>
		<li>פלסמיד pUC19 DNA (100 pg / μl)</li>
		<li>ערכת מיני-הכנה ספין QIAprep (קיאגן)</li>
		<li>
הינדי אנזים הגבלת III</li>
		<li>1 kb בתוספת סולם DNA</li>
		<li>אגרוז נקודת התכה נמוכה</li>
		<li>1X TAE buffer (בסיס טריס 40 מ"מ, 20 מ"מ חומצה אצטית ו-1mM EDTA)</li>
		<li>אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
הערות בטיחות כלליות אי קולי DH5α מסווג כ-Biosafety רמה 1 (BSL1). חיידקים בקטגוריה זו מהווים איום קטן עד לא קטן של זיהום אצל מבוגרים בריאים. עם זאת, נדרשת מניפולציה זהירה של המיקרואורגניזם.</li>
</ol>חשוב כל השלבים בפרוטוקול זה צריך להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות ועל קרח או 4 מעלות צלזיוס, אלא אם צוין.
2. פרוטוקול
<ol><li>מתוך מלאי קפוא של E. coli DH5α (קפוא ב 20% גלילסול מתרבות לילה גדל LB) פס החוצה חיידקים לבידוד על צלחת אגר LB. דגירה ב 37°C לילה (16-20 שעות).</li>
	<li>לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק LB בצינור. תגדלו רועדים ב-210 סל"ד ב-37°C בלילה (16-20 שעות).</li>
	<li>מדוד את OD600 של תרבות הלילה. השתמש בתרבות הלילה כדי לחסן 100 מ"ל של מרק LB בבקבוקון 1 ליטר ל- OD600 = 0.01. לדגור על התרבות רועדת במרץ (210 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס ניטור OD600 בספקטרופוטומטר כל 15-20 דקות, עד התרבות מגיעה OD600 = 0.35 (כ 3 שעות). הערה: כדי שהטרנספורמציה תהיה יעילה, תאים חיידקיים צריכים להיות בשלב צמיחה בינוני מעריכי. המספר המרבי של תאים צריך להיות 108 תאים / מ"ל, אשר עבור רוב הזנים של E. coli מתאים OD600 = 0.4. השימוש בספקטרופוטומטר מאפשר למדוד את OD600, המאפשר לקבוע כי התאים נמצאים בשלב הצמיחה המתאים. אם פרוטוקול זה ישמש לזנים אחרים של חיידקים, כיול כדי לקבוע את מספר המושבות היוצרות יחידות בערכי OD600 ספציפיים יהיה צורך לקבוע מתאם זה.</li>
	<li>העבר את 50 מ"ל של התרבות לכל אחד מ -2 בקבוקי צנטריפוגה פוליפרופילן קר כקרח. מניחים את הבקבוקים על קרח במשך 20 דקות כדי להתקרר.</li>
	<li>לשחזר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 2700g (4100 סל"ד ברוטור GSA סורבאלי) במשך 10 דקות ב 4°C.</li>
	<li>הסר את סופר-טבעי. לנקז את עקבות האחרונים של מדיה על ידי הנחת הבקבוק הפוך על כרית או מגבת נייר.</li>
	<li>resuspend כל גלולה חיידקית לתוך 30 מ"ל של CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2,20 mM CaCl2) פתרון קר כקרח. ראשית להוסיף 5 מ"ל של הפתרון, מערבולת בזהירות עד הכדור נמס לחלוטין ולאחר מכן להוסיף את 25 מ"ל הנותרים של פתרון.</li>
	<li>חזור על שלב 2.4.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5.</li>
	<li>אם תאים מוסמכים הולכים להשתנות ישירות, resuspend כל גלולה חיידקית לתוך 2 מ"ל של CaCl2 (0.1 M) פתרון קר כקרח על ידי מערבולת הצינורות בזהירות. אם הכדור אינו מקבל resuspended עם שיטה זו, resuspend על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה (הימנעות היווצרות בועה). לחלופין, ניתן להקפיא ולאחסן את התאים המוסמכים לשימוש מאוחר יותר. כדי להכין מלאי קפוא של תאים מוסמכים, resuspend הכדור ב 2 מ"ל של פתרון 0.1M CaCl2 המכיל 10% (v/ v) גליסrol. פתרון זה צריך להיות קר כקרח. השעיית תאי Aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל קרים כקרח (160 μl לכל צינור). להקפיא תאים מוסמכים מיד באמבט קרח / אתנול יבש. מעבירים צינורות למקפיא בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להפוך את CaCl2תאים שטופלו, להעביר 50 μl של תאים מוסמכים לכל אחד 2 צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל. הוסף את 1 μl (100 pg) של PUC19 plasmid DNA לאחד הצינורות ולהשאיר את הצינור השני ללא DNA (שליטה שלילית). מערבבים בעדינות (הימנעו מהיווצרות בועה). דגירה במשך 30 דקות על קרח. הערה: לא יותר מ 50 ננוגרם של DNA בנפח של 10 μL או פחות צריך לשמש טרנספורמציה.</li>
	<li>מעבירים את הצינורות לבלוק החום ודגר ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 מעלות בדיוק. הערה: הלם חום הוא צעד קריטי. אין לחרוג מהטמפרטורה או זמן הדגירה.</li>
	<li>בקלות להעביר צינורות לקרח. דגירה במשך 2 דקות.</li>
	<li>הוסף 950 μL של מדיה SOC ודגור את הצינורות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחיידקים להתאושש ולהביע את הסמן עמיד לאנטיביוטיקה מקודד plasmid.</li>
	<li>לדלל 10 μL של השעיית התא ב 1000 μL ב SOC (1/100 דילול) ו 100 μL של השעיית התא ב 1000 μL ב SOC (1/10 דילול). צלחת 100 μl של דילול, כמו גם את השליטה, על לוחות סלקטיביים, ולהפיץ באמצעות מרית. בדרך כלל, ציפוי 100 μL של דילול 1/100 ו 1/10 יניב מספיק מספר של מושבה להרכיב יחידות (cfu) לכל צלחת. באופן אידיאלי, מספר זה צריך לנוע בין 30-300 cfu, כך שיש מספיק מושבות אבל מופרדים אחד מהשני. עם זאת, מספר cfu יהיה תלוי ביעילות ההמרה (ראה ניתוח נתונים ותוצאות סעיף).</li>
	<li>לדגור על הצלחות ב 37°C. מושבות שעברו טרנספורמציה אמורות להופיע בעוד 12-16 שעות (טווח זה יהיה תלוי במתח התא ובשיטת הבחירה). אף מושבה לא צריכה לגדול בשליטה השלילית.</li>
	<li>ספר את cfu / צלחת המתקבל עבור ההמרה(טבלה 1).</li>
	<li>כדי לאמת את טרנספורמטורים מחסה pUC19 plasmid, הכנה plasmid ועיכול לאחר מכן יבוצע. כדי לשים קץ, לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק LB בצינור. תגדלו רועדים ב-210 סל"ד ב-37°C בלילה (16-20 שעות).</li>
	<li>הכן הכנת פלסמיד באמצעות ערכת מיני-הכנה ספין QIAprep, בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לעכל את 1 מיקרוגרם של pUC19 מטוהר עם אנזים ההגבלה HindIII ב 37°C במשך 1 שעה. הערה: כל אנזים שחותך באתר שיבוט מרובים pUC19 יכול לשמש עבור שלב זה.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר תקציר הגבלות של 10X</td>
			<td>2.5 מיקרול</td>
		</tr>
<tr>
<td>פלסמיד pUC19</td>
			<td>1 מיקרוגרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>
הינדי השלישי</td>
			<td>1 מיקרול</td>
		</tr>
<tr>
<td>ח2O</td>
			<td>20.5 μl (ל 25 μl)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>הפעל סולם משקל מולקולרי, DNA pUC19 מעוכל ואותה כמות של DNA pUC19 לא מעוכל בג'ל אגרוז 1% המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל אתידיום ברומיד במשך שעה אחת ב 95 V. הערה: הזמן והמתח ישתנו בהתאם לציוד המשמש.</li>
	<li>דמיינו ג'ל תחת אור UV. השווה את גודל הדנ"א pUC19 המעוכל והבלתי מעוכל(איור 2)(ראה סעיף ניתוח נתונים ותוצאות). המשך בצעדים הדרושים כדי לאמת את השינוי בהתאם למטרה של כל ניסוי טרנספורמציה מסוים.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> איור 2: עיכול של DNA פלסמיד שהתאושש מתאי DH5α שעברו טרנספורמציה. DNA Plasmid התאושש מתאי DH5α שעברו טרנספורמציה, מתעכלים עם HindIII, לרוץ בג'ל אגרוז 1% ודמיינו עם מקור UV (שלבים 2.19 עד 2.22).
3. ניתוח נתונים ותוצאות
כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה, אינדיקטור עד כמה התאים לקחו את ה- DNA החוץ-תאי, המושבות שהושגו בטרנספורמציה צריכות להיספר:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>דילול</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: יחידות יוצרות מושבה (cfu) שנספרו מניסוי טרנספורמציה.
יעילות טרנספורמציה (TE) היא מדד של מספר cfu הנובע מהפיכת 1 מיקרוגרם של plasmid לאמצעי אחסון נתון של תאים מוסמכים. פרמטרים רבים משפיעים על יעילות הטרנספורמציה: גודל plasmid, גנוטיפ התא, שלב הצמיחה במהלך הכנת יכולת, שיטות של טרנספורמציה, וכו '). בעת חישוב TE חשוב לשקול איזה דילול (אם בכלל) בוצע לפני ה ציפוי ולשלב אותו בחישוב המספר הכולל של cfu. יעילות ההמרה (TE) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
ראשית לחלק את cfu על ידי מיקרוגרם של DNA, בדוגמה זו 0.0001μg. לאחר מכן לחלק את התוצאה על ידי גורם הדילול. בדוגמה זו, נעשה שימוש בדילול של 1/10 ו- 100μL של פתרון 1 מ"ל היה מצופה (דילול: 1/10 × 100 μL / 1000 μL = 0.01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

טרנספורמציה היא שיטה רבת עוצמה להכנסת דנ"א אקסוגני לתאי חיידקים שהיא המפתח ליישומי ביולוגיה מולקולרית רבים במעבדה. בנוסף, הוא ממלא תפקיד מרכזי בטבע על ידי מתן אפשרות לתאי חיידקים להחליף חומר גנטי שעלול לגרום לשינוי גנטי מוגבר ולאפשר רכישת תכונות מועילות שונות להישרדות תחת מגוון רחב של תנאים. זני חיידקים רבים מקודדים את הגנים הנדרשים לכשירות טבעית. עם זאת, התנאים שבהם גנים אלה מושרים עדיין אינם ידועים. דרוש מחקר נוסף כדי לקבוע תנאים אלה.

טרנספורמציה של תאי e. coli באמצעות הליך סידן כלוריד מותאם

מקור: נטליה מרטין1, אנדרו ג'יי ואן אלסט1, ריאנון מ. לה-ווק1, וויקטור ג'יי דיריטה1 1 המחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית, אוניברסיטת מדינת מישיגן
לחיידקים יש את היכולת להחליף חומר גנטי (חומצה דוקסירובונוקלאית, DNA) בתהליך המכונה העברת גנים אופקית. שילוב דנ"א אקסוגני מספק מנגנון שבאמצעותו חיידקים יכולים לרכוש תכונות גנטיות חדשות המאפשרות להם להסתגל לתנאי הסביבה המשתנים, כגון נוכחות של אנטיביוטיקה או נוגדנים (1) או מולקולות שנמצאות בבתי גידול טבעיים (2). ישנם שלושה מנגנונים של העברת גנים אופקית: טרנספורמציה, טרנסדוקציה והטיה (3). כאן נתמקד בטרנספורמציה, ביכולתם של חיידקים לקחת דנ"א חופשי מהסביבה. במעבדה, תהליך הטרנספורמציה כולל ארבעה שלבים כלליים: 1) הכנת תאים מוסמכים, 2) דגירה של תאים מוסמכים עם DNA, 3) שחזור התאים, ו -4) ציפוי התאים לצמיחה של הטרנספורמטים (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> איור 1: שלבים כלליים של תהליך הטרנספורמציה. תהליך הטרנספורמציה כולל ארבעה שלבים כלליים: 1) הכנת תאים מוסמכים, 2) דגירה עם DNA, 3) שחזור התאים ו -4) תאי ציפוי לצמיחת הטרנספורמציה.
כדי שהשינוי יתרחש, חיידק הנמען חייב להיות במצב המכונה כשירות. חיידקים מסוימים יש את היכולת להיות מוכשר באופן טבעי בתגובה לתנאים סביבתיים מסוימים. עם זאת, חיידקים רבים אחרים אינם הופכים כשירים באופן טבעי, או התנאים לתהליך זה עדיין לא ידועים. היכולת להכניס DNA לחיידקים יש מגוון של יישומי מחקר: ליצור עותקים מרובים של מולקולת DNA של עניין, להביע כמות גדולה של חלבונים, כמרכיב בהליכי שיבוט, ואחרים. בגלל הערך של טרנספורמציה לביולוגיה מולקולרית, ישנם מספר פרוטוקולים שמטרתם להפוך תאים כשירים באופן מלאכותי כאשר התנאים לכשירות טבעית אינם ידועים. שתי שיטות עיקריות משמשות להכנת תאים מוסמכים באופן מלאכותי: 1) באמצעות טיפול כימי בתאים ו -2) חשיפת התאים לפולסים חשמליים (אלקטרופורציה). הראשון משתמש בכימיקלים שונים בהתאם להליך כדי ליצור משיכה בין ה- DNA לבין פני התא, בעוד האחרון משתמש בשדות חשמליים כדי ליצור נקבוביות בקרום התא החיידקי שדרכו מולקולות DNA יכולות להיכנס. הגישה היעילה ביותר לכשירות כימית היא דגירה עם סיעות דיווה, בעיקר סידן (Ca2+) (4,5) יכולת הנגרמת על ידי סידן היא ההליך שיתואר כאן (6). שיטה זו משמשת בעיקר להפיכת חיידקים גרם שלילי, וזה יהיה המוקד של פרוטוקול זה.
הליך הטרנספורמציה הכימית כרוך בסדרה של שלבים שבהם תאים נחשפים לתשואות כדי לגרום לכשירות כימית. צעדים אלה מלווה לאחר מכן בשינוי טמפרטורה - הלם חום - המעדיף את ספיגת ה- DNA הזר על ידי התא המוסמך (7). מעטפות תאי החיידקים טעונות לרעה. בחיידקים גרם שליליים כמו Escherichia coli, הממברנה החיצונית טעונה לרעה בשל נוכחות של ליפופוליסכריד (LPS) (8). התוצאה היא דחייה של מולקולות הדנ"א הטעונות באופן שלילי דומה. באינדוקציה של כשירות כימית, יוני סידן טעונים חיובית מנטרלים את דחיית המטען ומאפשרים ספיגת DNA על פני התא (9). טיפול בסידן ודגורה עם DNA נעשים על קרח. לאחר מכן, דגירה בטמפרטורות גבוהות יותר (42 מעלות צלזיוס), הלם החום, מבוצעת. חוסר איזון טמפרטורה זה מעדיף עוד יותר את ספיגת ה- DNA. תאים חיידקיים צריכים להיות בשלב הצמיחה הבינוני כדי לעמוד בטיפול בהלם חום; בשלבי גדילה אחרים תאי החיידק רגישים מדי לחום וכתוצאה מכך אובדן הכדאיות אשר מקטין באופן משמעותי את יעילות הטרנספורמציה.
מקורות DNA שונים יכולים לשמש לטרנספורמציה. בדרך כלל, פלסמידים, מולקולות דנ"א מעגליות קטנות, כפולות גדילים, משמשות לטרנספורמציה ברוב הליכי המעבדה ב- E. coli. כדי שפלסמידים יישמרו בתא החיידקי לאחר הטרנספורמציה, הם צריכים להכיל מקור של שכפול. זה מאפשר להם להיות משוכפל בתא החיידקי באופן עצמאי מן כרומוזום חיידקי. לא כל תאי החיידקים משתנים במהלך הליך הטרנספורמציה. לכן, טרנספורמציה מניבה תערובת של תאים שעברו טרנספורמציה ותאים שאינם שעברו טרנספורמציה. כדי להבחין בין שתי אוכלוסיות אלה, נעשה שימוש בשיטת בחירה לזיהוי התאים שרכשו את הפלסמיד. Plasmids מכילים בדרך כלל סמנים ניתנים לבחירה, שהם גנים קידוד תכונה המעניקה יתרון לצמיחה (כלומר עמידות לאנטיביוטיקה או כימית או הצלה מ auxotrophy צמיחה). לאחר הטרנספורמציה, תאים חיידקיים מצופים במדיה סלקטיבית, המאפשרת רק צמיחה של התאים שהשתנו. במקרה של תאים שהשתנו עם פלסמיד המעניק עמידות לאנטיביוטיקה נתונה, התקשורת הסלקטיבית תהיה מדיה צמיחה המכילה את האנטיביוטיקה. ניתן להשתמש במספר שיטות שונות כדי לאשר כי המושבות הגדלות במדיה הסלקטיבית הן טרנספורמטים (כלומר שילבו את הפלסמיד). לדוגמה, plasmids ניתן לשחזר תאים אלה באמצעות שיטות הכנה plasmid (10) מתעכל כדי לאשר את גודל plasmid. לחלופין, ניתן להשתמש ב- PCR המושבה כדי לאשר את נוכחותו של plasmid של עניין (11).
מטרת הניסוי היא להכין תאים בעלי יכולת כימית E. coli DH5α, תוך שימוש בהסתגלות של הליך הסידן כלוריד (12), ולהפוך אותם עם pUC19 פלסמיד כדי לקבוע את יעילות הטרנספורמציה. זן E. coli DH5α הוא זן נפוץ ביישומי ביולוגיה מולקולרית. בגלל הגנוטיפ שלה, במיוחד recA1 ו endA1, זן זה מאפשר יציבות הכנס מוגברת ולשפר את איכות ה- DNA plasmid בהכנות הבאות. מאז יעילות הטרנספורמציה פוחתת עם הגדלת גודל ה- DNA, pUC19 plasmid שימש בפרוטוקול זה בגלל גודלו הקטן (2686 bp) (ראה https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html עבור מפה וקטורית). pUC19 מעניק עמידות אמפיצ'ילין ולכן, זה היה האנטיביוטיקה המשמשת לבחירה.

למרות ש- TE תלוי בגורמים רבים, תכשירי תאים שאינם מסחריים, כמו זה, מניבים בדרך כלל 106 עד10 7 טרנספורמטים למיקרוגרם של פלסמיד. לכן, הכנה זו, עם TE = 2.46 x 108 cfu/μg, הניבה TE הרבה מעבר לטווח הצפוי. פרוטוקולים נוספים זמינים ליצירת תאים בעלי יכולת-על כאשר נדרשות יעילות המרה גבוהה יותר עבור יישום נתון (13).
ניתוח העיכול של ה- DNA plasmid התאושש מן התאים שהשתנו עולה כי plasmid זה יש...

טרנספורמציה של תאי E. coli באמצעות הליך סידן כלוריד מותאם

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

חיידקים מסתגלים להפליא ומנגנון אחד המאפשר הסתגלות זו הוא יכולתם לקלוט מולקולות DNA חיצוניות. סוג אחד של דנ"א שחיידקים יכולים לספוג נקרא פלסמיד, פיסת דנ"א מעגלית שמכילה לעתים קרובות מידע שימושי, כמו למשל גנים של עמידות לאנטיביוטיקה. תהליך השינוי של חיידקים על ידי מידע גנטי חדש המשולב ממקור חיצוני מכונה טרנספורמציה. ניתן לבצע טרנספורמציה בקלות במעבדה באמצעות Escherichia coli, או E. coli. על מנת לעבור טרנספורמציה, תאי E. coli חייבים קודם כל להיות מיומנים, כלומר מסוגלים לקלוט מולקולות DNA מסביבתם. הפרוטוקול להשגת זה פשוט להפליא, דגירה קצרה של התאים בתמיסת סידן כלורי. הדגירה הזו גורמת לתאים להיות חדירים למולקולות DNA. לאחר שהתאים מגולגלים על ידי צנטריפוגה, מסירים את הסופרנטנט. ה- DNA של הפלסמיד מתווסף כעת לתאים המוכשרים. לאחר הדגירה של התאים ב-DNA, התערובת מחוממת לזמן קצר ל-42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קירור מהיר על קרח. הלם חום זה גורם להעברת ה-DNA על פני דופן התא והממברנות. לאחר מכן התאים מודגרים במדיה טרייה. לאחר מכן, החיידקים ממוקמים ב-37 מעלות כדי לאפשר להם לאטום מחדש את הממברנות שלהם ולבטא חלבונים עמידים. אותם תאים שקלטו את הפלסמידים יעתיקו בנאמנות את ה-DNA ויעבירו אותו לצאצאיהם ויבטאו את כל החלבונים שעשויים להיות מקודדים על ידו, כולל מתווכי עמידות לאנטיביוטיקה. גנים עמידים אלה יכולים לשמש כסמנים הניתנים לבחירה לזיהוי חיידקים שעברו טרנספורמציה מוצלחת מכיוון שתאים שלא קלטו את הפלסמיד לא יבטאו את תוצר הגן העמיד. המשמעות היא שכאשר התאים מצופים על מדיום מוצק המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה, רק תאים שלקחו את הפלסמיד יגדלו. ניתן לאשר עוד יותר את הטרנספורמציה של התאים במושבה גדלה על ידי תרבית תאים אלה במדיה נוזלית בן לילה כדי להגדיל את התשואה לפני חילוץ ה-DNA מהדגימה. לאחר בידוד ה- DNA, ניתן לבצע עיכול אנזים הגבלה אבחנתי. מכיוון שאנזימי הגבלה חותכים DNA במקומות צפויים, הפעלת עכלים אלה על ג'ל אמורה להראות דפוס צפוי אם הפלסמיד הרצוי עבר טרנספורמציה מוצלחת. לדוגמה, אם מכינים pUC19 וחותכים אותו עם אנזים ההגבלה HindIII, יש לראות רצועה אחת של 2686 נוקלאוטידים על הג'ל. במעבדה זו, תמיר את זן E. coli DH-5 Alpha עם pUC19, ולאחר מכן תאשר את הטרנספורמציה המוצלחת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל DNA. לפני תחילת ההליך, יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות. לאחר מכן, עקרו את סביבת העבודה עם 70% אתנול. כעת, הכינו תאים בעלי יכולת כימית על ידי הפקדת לולאה מלאה בחיידקים על צלחת אגר LB סטרילית ופזר את החיידקים בלולאה חדשה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, עקרו שוב את משטח הספסל עם 70% אתנול, והוציאו את הצלחת מהחממה. חסנו מושבה אחת ומבודדת היטב לתוך 3 מיליליטר מרק LB בצינור עם לולאה סטרילית. לאחר מכן, גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה, עם רעידות ב-210 סל"ד. למחרת, מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, הוסף 100 מיליליטר מרק LB לבקבוק של ליטר אחד, וחסן אותו בתרבית הלילה בצפיפות אופטית של 0. 01. כעת, דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול, ובדקו את ה-OD600 כל 15 עד 20 דקות עד שהתרבות מגיעה לשלב הצמיחה האקספוננציאלי האמצעי. לאחר כשלוש שעות, העבירו 50 מיליליטר מהתרבות לשני בקבוקי פוליפרופילן קרים כקרח. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקים בחזרה על קרח למשך 20 דקות להתקררות. לאחר מכן, שחזר את התאים באמצעות צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנטים והניחו את הבקבוקים הפוכים על מגבת נייר. לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת החיידקים בחמישה מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד מגנזיום כלוריד קרה כקרח וסובבו בזהירות עד שהגלולה התמוססה לחלוטין. לאחר מכן, הוסף עוד 25 מיליליטר מהתמיסה לגלולת החיידקים המומסת. השעו מחדש את כדור החיידקים השני כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנטים. אם התאים המוסמכים עומדים לעבור טרנספורמציה ישירה, השעו מחדש כל כדור חיידקי בשני מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד 0.1 מולרית קרה כקרח על ידי סיבוב הצינורות בזהירות. כדי להתחיל בהליך הטרנספורמציה, העבירו 50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים לשני צינורות פוליפרופילן מסומנים בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של DNA פלסמיד pUC19 לאחד הצינורות. מערבבים בעדינות, הימנעות מהיווצרות בועות, ודוגרים על שני הצינורות למשך 30 דקות על קרח. לאחר הדגירה מעבירים את הצינורות לגוש חום ודוגרים בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. מעבירים מיד את הצינורות לקרח, ודוגרים למשך שתי דקות. כעת, הוסף 950 מיקרוליטר של מדיה SOC לכל צינור ודגר אותם למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחיידקים להתאושש, ולבטא את הסמן העמיד לאנטיביוטיקה המקודד בפלסמיד. כדי לבצע דילול של 1 עד 100, הוסף 990 מיקרוליטר של מדיה SOC ו-10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, בצע דילול של 1 עד 10 על ידי הוספת 900 מיקרוליטר של מדיית SOC ו-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צלחו 100 מיקרוליטר של מתלי התאים המדוללים ו -100 מיקרוליטר של הבקרה השלילית, על צלחות סלקטיביות נפרדות המכילות אמפיצילין באמצעות מפזר ודגרו את הצלחות ב -37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר הדגירה, ספרו את היחידות היוצרות מושבה, או CFUs, לכל צלחת, המתקבלות באמצעות טרנספורמציה, ורשמו את הנתונים הללו. כדי לוודא שלשנאים יש את הפלסמיד pUC19, בחר מושבה בודדת ומבודדת היטב מצלחת עם לולאה סטרילית, והכנס אותה לצינור המכיל 3 מיליליטר מרק LB. לאחר מכן, דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול, למשך הלילה. למחרת, השתמש בערכת הכנת DNA מיני כדי לבודד DNA מ-3 מיליליטר של התרבית, על פי הוראות היצרן. לאחר השלמת הכנת המיני DNA, עכל את המיקרוגרם 1 של pUC19 מטוהר עם אנזים הגבלה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. כעת, טען 20 מיקרוליטר של סולם משקל מולקולרי, 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מעוכל ומיקרוגרם אחד של DNA פלסמיד לא מעוכל לבארות עוקבות של ג'ל אגרוז 1% המכיל 1 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד. לאחר מכן, הפעל את הג'ל למשך שעה אחת ב 95 וולט. לבסוף, דמיינו את הג'ל עם תאורת UV. בניסוי זה, תאים בעלי יכולת כימית של E. coli DH5 Alpha הוכנו באמצעות התאמה של הליך הסידן הכלורי, ולאחר מכן עברו טרנספורמציה עם הפלסמיד pUC19 כדי לקבוע את יעילות הטרנספורמציה. כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה, השתמש בספירת ה-CFU המתועדת עבור הדילולים של 1 ל-100 ו-1 ל-10, ובכל דילול אחר עם ספירת CFU בין 30 ל-300. ראשית, ספירת ה-CFU המתועדת 246 בדוגמה הזו מחולקת בכמות הדנ"א, 0.0001 מיקרוגרם כאן, שהייתה מצופה. לאחר מכן, מספר זה מחולק בגורם הדילול המשמש למתן יעילות הטרנספורמציה ביחידות CFU למיקרוגרם. בדוגמה זו, נעשה שימוש בדילול של 1 עד 10 ו-100 מיקרוליטר של תמיסה של 1 מיליליטר צופה, מה שנותן מקדם דילול סופי של 0.01. בנתיב הפלסמיד הלא מעוכל, ה-DNA המעגלי עשוי להופיע כשתיים או שלוש רצועות שונות בבהירות משתנה. הסיבה לכך היא שה-DNA המעגלי והלא חתוך עשוי להתקיים במספר מצבי קונפורמציה שונים, כגון סליל-על, מעגל פתוח או ליניארי יותר, וכל אחד מאלה נע דרך הג'ל בקצבים שונים. ניתוח עיכול ה-DNA של הפלסמיד המשוחזר הצביע על כך שלפלסמיד המשמש יש גודל צפוי של pUC19 DNA, 2,686 זוגות בסיסים.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Microbiology

מיקרוביולוגיה

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards