ניתוח אנזימי בידוד והגבלה של DNA
At the end of this lab, students should know...
מהם השלבים החיוניים לבידוד DNA?
השלבים החיוניים לבידוד דנ"א הם קצירת תאים, ליזה, פירוק חלבונים ומשקעים בדנ"א.
כיצד נקבעת כמות הדנ"א וטוהרו?
מדענים משתמשים בספקטרופוטומטר, המודד את עוצמת קרן האור המועברת דרך דגימה כפונקציה של אורך הגל שלה. על ידי כימות התפוקה של אורכי גל ספציפיים לחומצות גרעין או זיהומים, ניתן לא רק לכמת את כמות הדנ"א אלא גם להעריך את טוהר דגימת הדנ"א.
מהו אנזים הגבלה?
זהו אנזים ממקור חיידקי שיכול לזהות רצפי דנ"א ספציפיים ולחתוך אותם למקטעים במקומות אלה.
כיצד אלקטרופורזה בג'ל משמשת לניתוח DNA?
מדענים יכולים לטעון דנ"א על ג'ל בתא אלקטרופורזה ולהעביר זרם חשמלי דרך הג'ל. דנ"א נושא מטענים שליליים, מה שגורם למקטעי דנ"א לנדוד לכיוון האנודה. עם זאת, נקבוביות הג'ל מאטות מקטעי דנ"א גדולים יותר ביחס לרצפי דנ"א קטנים יותר, ולכן החתיכות נפרדות בהתאם לגודלן.
מדוע פרופיל גנטי חשוב?
בידוד דנ"א ויצירת פרופיל היו הצעדים הראשונים הבסיסיים עבור רבים מהפיתוחים במאה האחרונה; מזיהוי תפקוד גנים, למהפכות של חקלאות וזיהוי פלילי. בנוסף, התקדמות זו סללה לאחרונה את הדרך לרפואה מותאמת אישית עם תוצאות טיפול משופרות.
-
מקלות ארטיק (1/קבוצה)5
-
משפכי זכוכית (1/group)5
-
15 מ"ל צינורות חרוטיים (2/קבוצה)10
-
כוסות שתייה (1/קבוצה)5
-
1% תמיסת NaCl (10 מ"ל בכוס שתייה/קבוצה)50
-
סמן קבוע (1/group)5
-
Beaker לאיסוף פסולת (1/group)5
-
מאגר ליזיס I: מאגר TE עם SDS (מאגר TES) (1 מ"ל/קבוצה)5 mL
-
מאגר Lysis II: מאגר TE ללא SDS (1 מ"ל/קבוצה)5 mL
-
Proteinase K (10 μL/ קבוצה)50 μL
-
2.5 M NaCl (100 μL/group)500 μL
-
אתנול 100% (4°C) (1 מ"ל/קבוצה)5 mL
-
מוטות זכוכית (2/group)10
-
שעון עצר (1/קבוצה)10
-
צינורות מיקרופוגה (1.5 מ"ל) (מלאה/תחנה)1 per station
-
מתלים למיקרופוגות קצף צף (1/station)1 per station
-
טלפון סלולרי עם מצלמה1 per group
-
ערכות פיפטה אוטומטיות (1 μL-1 מ"ל)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
עצות פיפטה (1 μL-1 מ"ל) 1box כל אחד/קבוצה-1 תלוי בגודל המעבדה
-
צנטריפוגת מיקרופוגה-1 תלוי בגודל המעבדה
-
אמבט מים (מוגדר ל-56°C)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
מים ללא נוקלאז (125 μL aliquot/group)125 μL
-
Lamda DNA (12 μL/group)12 μL
-
מאגר NEB 2.1 (15 μL/קבוצה)15 μL
-
אנזים הגבלה 1 (StuI) (1 μL/קבוצה)1 μL
-
אנזים הגבלה 2 (BsrGI) (1 מיקרוליטר/קבוצה)1 μL
-
Stop watch (1/group)5
-
Enzyme cooler-1 תלוי בגודל המעבדה
-
אמבט מים (מוגדר ל-37°C)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
מחשב עם חיבור לאינטרנט-1 תלוי בגודל המעבדה
-
אבקת אגרוז-1 תלוי בגודל המעבדה
-
Tris-Acetate-EDTA buffer-1 תלוי בגודל המעבדה
-
כתם ג'ל בטוח Syber (10,000X) (10 μl/100mL ג'ל)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
6X צבע טעינה-1 תלוי בגודל המעבדה
-
1 KB סולם DNA-1 תלוי בגודל המעבדה
-
מאזן שקילה1 מחלקה שלמה
-
מיקרוגל1 מחלקה שלמה
-
מנגנון ג'ל DNA1 מחלקה שלמה
-
UV transilluminator1 מחלקה שלמה
- הכנת פתרונות וחומרים
- הערה: כדי שמעבדה זו תפעל בצורה חלקה, מומלץ לא לחרוג מ-12 דגימות לכל מחלקת מעבדה.
- ראשית לאסוף את החומרים הדרושים, כולל מקלות ארטיק, משפכים, צינורות חרוטי 15 מ"ל, micropipettes, דליי קרח עם קרח, כוסות קטנות צינורות microcentrifuge.
- לאחר מכן הגדר את אמבט המים המשמש בחלק הראשון של תרגיל המעבדה, ל 56 ° C.
- הגדר אמבט מים שני לשימוש בחלק השני של תרגיל המעבדה ל -37 מעלות צלזיוס.
- כדי ליצור חיץ TE, מדדו תחילה 400 מ"ל של מי RO.
- לאחר מכן הוסף חמישה מ"ל של 1M Tris-HCL pH 8, ולאחר מכן 1 מ"ל של תמיסת 0.5 M EDTA.
- לאחר מכן, הוסף מספיק מי RO כדי להביא את התמיסה עד 500 מ"ל.
- כדי ליצור חיץ TE עם SDS או TES buffer, מדדו שוב 400 מ"ל של מים RO.
- הוסף חמישה מיליליטר של 1M Tris-HCL pH 8, ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל של תמיסת EDTA מולרית 0.5.
- כעת הוסף 5 מ"ל של פתרון SDS 10%.
- הבא את עוצמת הקול עד 500 מ"ל, באמצעות מי RO.
- לאחר מכן, הכינו את תמיסת המלח 1% שהתלמידים ישתמשו בה לאיסוף תאי לחיים. בבקבוק סודה ריק ונקי, יש להמיס 5 גרם של NaCl ב-500 מ"ל של מי RO.
- מזגו 10 מ"ל אליציטוטים לכוסות שתייה קטנות לשימוש התלמידים, אחת לכל קבוצת תלמידים.
- לאחר מכן, הכינו כמות מספקת של 10 מ"ל aliquots של 100% אתנול לשימוש התלמידים. הערה: אחסנו את אליציטוטי האתנול האלה במקפיא או במקרר כדי לשמור עליהם עדיפים קרים כקרח.
Q1: What materials do you need to prepare before starting a DNA isolation lab?
Gather popsicle sticks, funnels, 15 mL conical tubes, micropipettes, ice buckets with ice, small cups, and microcentrifuge tubes. Prepare two water baths set to 56°C and 37°C for different lab stages. Limit the lab to no more than 12 samples per class to ensure smooth execution and proper handling of all materials.
Q2: How do you prepare TE buffer for DNA isolation?
Measure 400 mL of reverse osmosis (RO) water, then add 5 mL of 1M Tris-HCl pH 8 and 1 mL of 0.5 M EDTA solution. Fill the remaining volume to 500 mL with RO water. This buffer protects DNA during isolation and restriction enzyme analysis procedures.
Q3: What is the difference between TE buffer and TES buffer?
TES buffer includes all TE buffer components—400 mL RO water, 5 mL of 1M Tris-HCl pH 8, and 1 mL of 0.5 M EDTA—plus an additional 5 mL of 10% SDS solution. The SDS detergent helps lyse cell membranes during DNA extraction. Both are brought to 500 mL final volume with RO water.
Q4: How should you prepare the saline solution for cheek cell collection?
Dissolve 5 grams of NaCl in 500 mL of reverse osmosis water in a clean soda bottle to create a 1% saline solution. Distribute 10 mL aliquots into small drinking cups, providing one cup per student group for collecting cheek cells during the lab.
Q5: Why is ethanol stored in the freezer or refrigerator before the lab?
Ethanol is stored ice-cold to facilitate DNA precipitation during the isolation process. Prepare 10 mL aliquots of 100% ethanol and keep them refrigerated or frozen. Cold ethanol increases DNA solubility differences, making it precipitate more effectively from the aqueous solution.
Q6: What temperature settings are required for the water baths in this lab?
Set one water bath to 56°C for part one of the laboratory exercise and a second water bath to 37°C for part two. These specific temperatures optimize enzyme activity and cell lysis during different stages of DNA isolation and restriction enzyme analysis.
Q7: How much TE buffer or TES buffer should you prepare for a typical lab class?
Prepare 500 mL of TE buffer or TES buffer as the standard preparation volume. Since the lab accommodates up to 12 samples per class, this volume provides sufficient buffer for cell lysis, DNA extraction, and subsequent washing steps across all student groups.