ניתוח אנזימי בידוד והגבלה של DNA
- DNA
- הערה: בניסוי זה תבצעו בידוד DNA בשני תנאי ניסוי: אחד באמצעות חיץ המכיל את חומר הניקוי SDS ואחד ללא חומר ניקוי. השערות: ההשערה החלופית לניסוי זה עשויה להיות שהדגימה שהוכנה ללא SDS, חומר ניקוי אניוני חזק המפרק את קרום התא, תניב פחות דנ"א מהדגימה שהוכנה עם SDS. השערת האפס של ניסוי זה עשויה להיות ששתי הדגימות יניבו כמות שווה של דנ"א.
- כדי להתחיל לאסוף דגימת רקמה לבידוד DNA. כאן תשתמש בתאי הלחי שלך. השתמשו במקל ארטיק כדי לגרד את החלק הפנימי של הלחיים למשך כ-30 שניות. חשוב: אין לגרד חזק מספיק כדי לגרום לכאב או לשאוב דם.
- מקם משפך בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- לאחר מכן קח 10 מ"ל של תמיסת מלח 1% שסופקה לך בכוס מסומנת וטפח אותה בפה מבלי לבלוע.
- המשך למרוח במשך 90 שניות ולאחר מכן לירוק את תמיסת המלח המכילה את תאי הלחי לתוך המשפך כדי לאסוף בצינור החרוט.
- לאחר מכן, תייגו שתי שפופרות מיקרוצנטריפוגות ריקות בראשי התיבות שלכם.
- תייגו את אחד הצינורות כ-+SDS ואת השני כ-SDS כדי להבדיל בין שני הטיפולים.
- לאחר מכן הוסף 1.5 עד 2 מ"ל של תמיסת מלח המכילה את תאי הלחי לכל צינור.
- סובבו את הצינורות במיקרו-צנטריפוגה במשך 30 שניות.
- הסר את הצינורות מהמיקרוצנטריפוגה ושפך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לתאים שנאספו בתחתית כל צינור.
- מלאו את הצינורות ביותר מתמיסת מלח המכילה את תאי הלחי וחזרו על הצנטריפוגה.
- חזור על תהליך זה תוך הקפדה על פיזור תאים שווה בין צינורות +SDS ו- -SDS עד שכל תאי הלחי נאספים.
- לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזיס המכיל SDS לצינור המסומן כ- +SDS, ולאחר מכן השעה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.
- לאחר מכן הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזיס ללא SDS לצינור המסומן ב-SDS והשהה מחדש את גלולת התא על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- לאחר מכן להוסיף 10 μL של proteinase K לכל צינור ולאחר מכן בזהירות להניח את הצינורות באמבט מים 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לאחר 10 דקות הסר בזהירות את הצינורות מאמבט המים והוסף 100 μL של 2.5 M NaCl לכל צינור.
- סגור את הצינורות בחוזקה והפוך מספר פעמים כדי לערבב.
- לאחר מכן, תייג צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל כ- +SDS ואחר עם -SDS.
- יוצקים את התוכן של כל צינור מיקרוצנטריפוגה לתוך הצינור החרוטי המתאים של 15 מ"ל.
- להשיג aliquot אחד 10 מ"ל של 100% אתנול מהמקפיא.
- החזק את אחד הצינורות החרוטיים בזווית ושחרר באיטיות 1 מ"ל של אתנול 100% לתוך הצינור כדי ליצור שכבה על גבי הנוזל שכבר נמצא בצינור.
- חזור על תהליך זה עבור הצינור החרוטי השני.
- עכשיו תסתכל על שני הצינורות שלך. צריך להיות משקע מיתר נוכח בממשק של אתנול ואת השכבה המימית מתחתיו. חומר מיתר זה מכיל את הדנ"א המבודד. צלם את הדנ"א שבצינור ורשום הערות וציורים תיאוריים ברורים של התצפיות שלך במחברת שלך.
- באמצעות מוט ערבוב זכוכית, הרימו את הדנ"א מצינור +SDS ובחנו אותו. חזור על כך עבור צינור -SDS, שוב הקלט את התצפיות שלך. שימו לב אם נראה שלאחד הצינורות יש יותר משקעים מהשני, ומדוע זה יכול להיות.
- לבסוף, השליכו את כל הפסולת הנוזלית למיכל הפסולת המתאים והחזירו את כל הכלים למיקומם הנכון במעבדה.
- Restriction Enzyme Virtual Digest
- כדי לחקור כיצד אנזימי הגבלה פועלים, נווט תחילה לאתר האינטרנט של New England Biolabs: https://www.neb.com/
- המשאבים הזמינים באתר זה מאפשרים לחוקרים לבצע ניסויים וירטואליים לפני שהם מבוצעים במעבדה. לחץ על "כלים ומשאבים" כדי למצוא את הכלי NEBcutter ולפתוח את התוכנית.
- משמאל לתיבת החיפוש מצא את הרשימה שאומרת "ויראלי + פאג'". מרשימה זו, בחר Lambda. זהו שמו של הדנ"א שתעכלו. בחר באפשרות ליניארית שבה הכלי אומר "the sequence is" ובאפשרות "NEB enzymes" שבה הכלי אומר "Enzymes to use". לאחר מכן לחץ על שלח.
- הדף הבא יציג מפת הגבלה מלאה של DNA lambda. מפת הגבלה זו יכולה לשמש לחיזוי מה יקרה אם אנזימים מסוימים ישמשו. לאחר מכן, לחץ על "תקציר מותאם אישית" תחת הכותרת "אפשרויות עיקריות".
- חפש את האנזים StuI ושים לב שהוא פועל בצורה אופטימלית במאגר 2.1 או במאגר CS. בחר את האנזים StuI ולחץ על תקציר.
- בחלון הבא לחץ על "הצג ג'ל" תחת הכותרת "אפשרויות עיקריות". בחר באפשרות להפעיל ג'ל וירטואלי 1% באמצעות תקציר pBR322-BstN1.
- לאחר הופעת התוצאות, צלם צילום מסך והדבק אותו במסמך ריק.
- לאחר מכן, נווט חזרה לדף הראשי של הכלי NEBcutter ובחר "תקציר מותאם אישית חדש".
- הפעם חפשו את האנזים BsrGI ושימו לב שהוא מתפקד בצורה אופטימלית במאגר 2.1 או במאגר 3.1. בחר את האנזים ולחץ על תקציר.
- תחת כותרת האפשרויות הראשיות, לחץ על "הצג ג'ל" ובחר את האפשרויות להפעלת ג'ל וירטואלי 1% באמצעות תקציר pBR322-BstN1.
- צלם צילום מסך של התוצאות ושמור אותו במסמך טקסט.
- לבסוף, חזור על שלבים אלה באמצעות StuI ו- BsrGI יחד בתקציר יחיד.
- שוב, צלם צילום מסך ושמור את הג'ל שנוצר.
- DNA Profiling
- לפני תחילת תקצירי אנזימי ההגבלה הכניסו תחילה את האליציטוטים של DNA lambda, חיץ NEB 2.1, אנזים StuI ואנזים BsrGI לדלי קרח, וקחו את זה לאזור העבודה שלכם.
- תייגו צינור כ-StuI – זה יכיל את תקציר StuI.
- תייגו צינור כ-BsrGI כדי להכיל את תקציר BsrGI.
- לאחר מכן, תייגו צינור S+B, כדי להכיל את העיכול עם שני האנזימים.
- השתמש במיקרו-פיפטרים המתאימים כדי להגדיר את התגובות המפורטות בטבלה 1:לחץ כאן להורדת טבלה 1
- ראשית, הזרימו את 40 μL המים לכל צינור.
- לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה טרי בכל פעם, יש לפזר 5 μL של חיץ 2.1 לכל צינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
- לאחר מכן, הוסף 4 μL של DNA lambda לכל צינור, ולאחר מכן פיפטה 0.5 μL של כל אנזים לתוך הצינורות המתאימים.
- לבסוף, הוסף כמות מספקת של מים לכל צינור כדי להביא את הנפח הכולל עד 50 μL.
- לאחר מכן, לדגור על הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 - 60 דקות באמבט מים, ולהחזיר את החוצצים והאנזימים למקפיא.
- כדי להכין ג'ל אגרוז להפעלת העיכול, בבקבוק 250 מ"ל לערבב 1 גרם אבקת אגרוז עם 100 מ"ל של מאגר TAE.
- חממו את התמיסה במיקרוגל למשך כ-90 שניות בעוצמה מלאה, תוך הקפדה על מניעת רתיחת התמיסה בחום.
- לאחר מכן, הוציאו בזהירות את התמיסה מהמיקרוגל באמצעות כפפה או כרית חום והניחו אותה להתקרר למשך כ-15 דקות.
- בזמן שתמיסת האגרוז מתקררת מקימים מגש יציקה.
- כאשר תמיסת האגרוז קרירה יש להוסיף לתמיסה 5 μL של כתם ג'ל SYBR Safe 10,000X.
- הוסף את המסרק המשמש להכנת בארות הג'ל למגש היציקה של מכשיר אלקטרופורזה ג'ל.
- יוצקים את תמיסת ג'ל האגרוז למגש היציקה ומאפשרים לה להתמצק.
- ברגע שהג'ל מוצק, משוך את המסרק ישר למעלה כדי להסיר אותו מהג'ל, ולאחר מכן הסר את הסכרים ממגש היציקה במידת הצורך.
- הניחו את הג'ל בתא האלקטרופורזה כאשר הבארות ממוקמות הכי קרוב לאלקטרודה השלילית או השחורה ומלאו את התא בחיץ 1x TAE כדי לכסות לחלוטין את הג'ל.
- הסר את הדגימות שלך מאמבט המים.
- לאחר מכן הוסף 8.3 μL של צבע טעינה 6X לכל דגימה.
- Dispense 10 μL של תקציר pBR322-BstN1 המכיל מקטעי DNA בגודל ידוע לתוך הבאר הראשונה.
- ואז לטעון 25 μL של StuI מדגם לתוך הבאר השנייה.
- מניחים 25 μL של דגימה BsRGI לתוך הבאר השלישית.
- טען 25 μL של מדגם S+B לבאר הרביעית.
- כדי להפעיל את הג'ל, חבר את הלידים לתא האלקטרופורזה ולאחר מכן לספק הכוח. העופרת החיובית האדומה צריכה להיות בקצה הרחוק ביותר מהבארות והעופרת השלילית השחורה צריכה להיות הקרובה ביותר לבארות. הסיבה לכך היא שהדגימות ירוצו משליליות לחיוביות.
- הפעל את ספק הכוח והגדר את קופסת הג'ל לפעול במתח של 170 וולט למשך כ-60 דקות.
- לאחר השלמת הריצה, כבה את החשמל לקופסת הג'ל ונתק את האלקטרודות מהמיכל.
- לאחר מכן הסר את הג'ל מתא האלקטרופורזה והתבונן בו עם טרנסילטור UV. אזהרה: יש להגן על העיניים מפני קרינת UV על ידי הרכבת משקפי מגן או שימוש במגן המצורף.
- לבסוף, השתמש במצלמת טלפון סלולרי כדי לצלם תמונה של הג'ל ישירות מעל ובמקביל למשטח הג'ל.
- Results
- השווה את הג'ל שהרצת במעבדה לעיכול האנזימטי הווירטואלי שלך עם StuI.
- התקציר הווירטואלי עם StuI הניב שבע להקות. ספור את הפסים בנתיב StuI של הג'ל שלך ושים לב אם זה תואם את תקציר וירטואלי או נראה להראות דפוס דומה. הערה: רצועות קטנות על ג'ל אלקטרופורזה אגרוז הן לעתים קרובות בלתי נראות.
- עכשיו תסתכל על התוצאות עבור תקציר BsrGI שלך. התקציר הווירטואלי עם BsrGI הניב שש להקות. ספור את הפסים בנתיב BsrGI. שוב, שימו לב אם תקציר וירטואלי ותקציר מעבדה הראו דפוס זהה או דומה.
- לבסוף, התבונן בתקציר הווירטואלי עם StuI ו- BsrGI. התקציר הווירטואלי עם שני האנזימים הניב 12 פסים. ספור את הפסים בנתיב המתאים של הג'ל שלך, ושקול אם תבנית פסי הדנ"א נראית דומה לעיכול הווירטואלי.
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.