פעילות אנזימים
At the end of this lab, students should know...
מהם אנזימים?
אנזימים הם זרזים ביולוגיים המגבירים את המהירות והיעילות של תגובות ביוכימיות. רוב האנזימים הם חלבונים, אך למולקולות מסוימות של חומצה ריבונוקלאית יש גם תכונות קטליטיות.
כיצד אנזימים מזרזים תגובות?
אנזימים מזרזים תגובות על ידי הורדת אנרגיית ההפעלה של תגובה.
מהן תגובות קטבוליות ואנבוליות?
רוב התגובות האנזימטיות יכולות להיות מסווגו...
-
מבחנות200
-
Test tube rack10
-
Dropper5
-
טיימר5
-
pH Chart5
-
Label tape5
-
Marker5
-
מצלמה/טלפון עם מצלמה5
-
Parafilm/סרט איטום1 per station
-
Hot plate1 per station
-
קוביית קרח (1/2 מגש)1 per station
-
מדחום1 per station
-
pH meter/pH strips1 for whole lab
-
סכין1 for whole lab
-
Blender1 for whole lab
-
בד גבינה (0.5 מטר)1 for whole lab
-
מסנן קפה1 for whole lab
-
0.1 M נתרן פוספט diobasic soln (250 מ"ל)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
0.1 M נתרן פוספט מונובסיסי (250 מ"ל)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
Turnip (1-2)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
מי חמצן (3%) (15 מ"ל)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
Guaiacol (concentrtion soln, 1-3mL)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
איזופרופיל שפשוף אלכהול (100mL)-1 תלוי בגודל המעבדה
-
pH buffer capsules/pH (pH range- 3-8)-1 תלוי בגודל המעבדה
- חקירת ההשפעה של pH וטמפרטורה על פעילות פרוקסידז
- כדי ליצור את מאגר המיצוי של אנזים הפרוקסידז, ערבבו נפחים שווים של 0.1 M נתרן פוספט מונובייסיק ו-0.1 נתרן פוספט מולרי dibasic כדי להשיג נפח סופי של 500 מ"ל.
- בדוק את הפתרון המתקבל באמצעות מד pH. התערובת צריכה להיות בין pH של 6.8 ו 7.2.
- כדי לחלץ את הלפת peroxidase, השתמש בסכין כדי להסיר את השכבה החיצונית של לפת ולאחר מכן לחתוך את הלפת לקוביות כשני ס"מ.
- הכניסו 30 גרם קוביות לפת לבלנדר עם מאגר מיצוי של 300 מ"ל, וערבבו את קוביות הלפת במהירות גבוהה שלוש פעמים במשך כ-15 שניות בכל פעם.
- סנן את התערובת ההומוגנית דרך שלוש שכבות של בד גבינה, ולאחר מכן סנן את התמיסה המתקבלת דרך מסנן קפה אחד.
- אחסנו את התסנין בבקבוק של 500 מ"ל, והכניסו מיד את הבקבוק למקרר.
- לאחר מכן, כדי ליצור את תמיסות מצע האנזים, תחילה להוסיף 15 מ"ל 3% H2O2 עד 435 מ"ל מים מזוקקים כדי לדלל את H2O2 לריכוז של 0.1%.
- כדי להכין את המגיב משנה הצבע, יש להמיס 0.2 מ"ל גואיאקול מרוכז ב-100 מ"ל של אלכוהול משפשף איזופרופיל, ולאחסן תמיסת גואיאקול זו במקרר.
- לאחר מכן, כדי ליצור פתרונות לתנאי ה- pH השונים, הוסף מים מזוקקים של 100 מ"ל לשש כוסות של 250 מ"ל, והנח את תכולת קפסולת החיץ עם pH של 3, 4, 5, 6, 7 ו- 8 לכוסות נפרדות.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: How do you prepare an extraction buffer for peroxidase enzyme experiments?
Mix equal volumes of 0.1 M sodium phosphate monobasic and 0.1 M sodium phosphate dibasic solutions to achieve a final volume of 500 mL. Test the resulting solution using a pH meter to ensure it falls between pH 6.8 and 7.2. This buffer maintains optimal enzyme stability during extraction and storage.
Q2: What steps are involved in extracting peroxidase from turnip tissue?
Remove the outer layer of a turnip and cut it into approximately two cm cubes. Place 30 g of turnip cubes into a blender with 300 mL extraction buffer, and blend at high speed three times for about 15 seconds each. Filter the homogenized mixture through three layers of cheesecloth, then strain through one coffee filter and refrigerate immediately.
Q3: How is the hydrogen peroxide substrate solution prepared for enzyme assays?
Add 15 mL of 3% hydrogen peroxide to 435 mL distilled water to dilute the H2O2 to a 0.1% concentration. This diluted substrate solution is used to measure enzyme activity by providing the substrate that the enzyme catalyzes, producing measurable color changes.
Q4: What is the purpose of guaiacol in peroxidase activity experiments?
Guaiacol serves as a color-changing reactant that indicates enzyme activity. Dissolve 0.2 mL concentrated guaiacol in 100 mL of isopropyl rubbing alcohol and store in the refrigerator. When peroxidase catalyzes the reaction with hydrogen peroxide, guaiacol undergoes oxidation, producing a visible color change that allows quantification of enzyme performance.
Q5: Why are multiple pH buffer solutions prepared separately in this experiment?
Multiple pH buffers allow investigation of how pH affects peroxidase activity. Add 100 mL distilled water to six 250 mL beakers and add buffer capsule contents with pH values of 3, 4, 5, 6, 7, and 8 to separate beakers. Testing enzyme activity across this pH range reveals the optimal pH for peroxidase function and demonstrates enzyme sensitivity to environmental conditions.
Q6: How does proper storage of extracted peroxidase enzyme affect experimental results?
The filtrate containing extracted peroxidase must be immediately placed in a refrigerator after preparation. Cold storage preserves enzyme structure and catalytic activity by slowing degradation and denaturation. Proper storage ensures consistent and reliable enzyme activity measurements throughout the experiment and maintains data integrity.
Q7: What role does enzyme substrate concentration play in measuring peroxidase activity?
The diluted 0.1% hydrogen peroxide substrate provides a consistent reaction medium for measuring enzyme kinetics and performance. Standardized substrate concentration ensures that observed activity changes reflect true differences in enzyme function under varying pH and temperature conditions rather than substrate availability limitations.