כרומטוגרפיית עמודות היא טכניקה המשתמשת בטור ארוז כדי להפריד תרכובות בהתבסס על האינטראקציות שלהן עם פאזה נייחת, שהיא בדרך כלל בצורה של חרוזים מיקרוסקופיים. החללים בין החרוזים מלאים בממס. פתיחת העמוד מאפשרת לממס לזרום דרך השלב הנייח. כאשר מורחים תערובת על החלק העליון של העמוד הארוז ואחריו עוד מהממס, התערובת עוברת לשלב הנייד וזורמת דרך הפאזה הנייחת.
כל רכיב של התערובת אינטראקציה עם השלב הנייח בצורה שונה. לחלק מהרכיבים יש אינטראקציות חלשות עם הפאזה הנייחת ולכן נעים במהירות דרך העמודה, בעוד שלאחרים יש אינטראקציות חזקות עם הפאזה הנייחת ולכן נעים לאט יותר. זה מפריד את התרכובות השונות ללהקות, אשר נאספים בשברים קטנים. זה מאפשר טיהור של כל תרכובת.
אז, איזה סוג של תכונות ניתן להשתמש כדי להפריד תערובות? אחת התכונות הנפוצות ביותר היא קוטביות. לשם כך, ג'ל סיליקה, שהוא צורה של דו תחמוצת הסיליקון, משמש לעתים קרובות כמו השלב נייח. ג'ל סיליקה מקיים אינטראקציה עם תרכובות על ידי אינטראקציות דיפול-דיפול וקשרי מימן דרך קבוצות -OH הנוצרות על פני השטח שלו. לפיכך, תרכובות קוטביות יתקשרו חזק עם הפאזה הנייחת, בעוד שתרכובות שאינן קוטביות יתקשרו בצורה חלשה.
תכונות אחרות שניתן לנצל להפרדה כוללות גודל, מטען והידרופוביות. דרך נפוצה לטעון את הפאזה הנייחת לתוך הטור היא כתרחיף של הפאזה הנייחת והממס. לאחר מכן, השלב הנייח ארוז על ידי הזרמת ממס נוסף דרך העמוד כדי לדחוס את הבוצה. חיוני שהשלב הנייח יהיה ארוז באופן אחיד ללא בועות אוויר, תעלות ריקות או כתמים יבשים. אלה יכולים לשבש את הזרימה ולגרום לערבוב של להקות.
בעת בחירת עמודה, הקוטר מבוסס על נפח המדגם שיש להפריד. הדגימה צריכה לכסות את החלק העליון של העמודה בשכבה דקה ואחידה. שכבת דגימה עבה יותר מובילה לפסים רחבים יותר. אורך העמודה תלוי עד כמה התרכובות נפרדות בפאזה הנייחת. תרכובות בעלות זיקות דומות לשלב הנייח דורשות טור ארוך להפרדה נאותה. עם זאת, תערובת של תרכובות עם זיקות שונות מאוד לשלב נייח ניתן להפריד על עמודה קצרה יותר.
במעבדה זו, תוכלו לחקור כרומטוגרפיית עמודות על ידי אריזה ראשונית והכנת עמוד ג'ל סיליקה. לאחר מכן, תשתמש בעמודה שלך כדי להפריד את הרכיבים הצבעוניים בצבע מאכל ירוק.
At the end of this lab, students should know...
כרומטוגרפיית עמודות כוללת פאזה ניידת ופאזה נייחת.
תרכובות נפרדות בהתבסס על האינטראקציות שלהן עם הפאזה הנייחת.
תרכובות המקיימות אינטראקציה חלשה עם הפאזה הנייחת מתקשרות תחילה מכיוון שהן מתקשרות חזק יותר עם הפאזה הניידת ולכן עוברות...
2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.