הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

19.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1125

⸱

26 במאי 2009

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Illinois, Chicago

במאמר זה

סיכום

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

תקציר

ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת

פרוטוקול

1. מתקן התקנה

  1. בידוד איון אדם היא הליך רגיש הזמן הכרוך בעבודת צוות, ומכאן, ארבעה בני אדם יש צורך לנהל הליך זה. הקבוצה היא להוביל על ידי המנתח, אשר מנתח ו cannulates את הלבלב.
  2. הבידוד איון מתחיל ברגע הצוות נכנס למתקן UIC בידוד איון. חברי הצוות להבטיח כי כל המכשור הדרוש, כמו צנטריפוגה, הוא בדק מופעלת. הם גם דואגים לטהר את כל ברדסים ומשטחים.
  3. שני אנשים יהיה להגדיר את הטבלה cannulation, מכונת ברד, מעגל העיכול, יחידת זלוף, מכונת טיהור COBE, ושולחנות כירורגית.
  4. במקביל, שני חברי צוות אחרים יכין התקשורת כי יש צורך במהלך הבידוד.
  5. בשלב הבא, צינורות בקטריולוגיה (בקבוקים, צינור, הטופס שקית), צינורות דגימה (טרום מלא לשטוף), צינורות הערכה וצלחות מוכנים.
  6. הכן את הצינור טיהור להגדיר כדלקמן: 1 שפופרת ריק מסומן ב 150 מ"ל, צינורות 2-12 מלא 200 מ"ל של M199 התקשורת בתוספת (פתרון לשטוף) אלבומין אנושי ומסומן ב 230 מ"ל, ולבסוף אחד 50 מ"ל צינור חרוטי מלאות 50 מ"ל של תמיסת לשטוף. לאחר השלבים הושלמו ההכנות אנחנו מוכנים להתחיל בהכנת המרוססת את הלבלב.

2. לבלב הכנה זלוף

  1. כדי להתחיל הכנה זלוף של הלבלב, מפעיל מסיר את איבר מן האריזה באמצעות טכניקה סטרילית. המנתח תעביר את הלבלב לשולחן טיהור.
  2. המנתח יהיה למלא את אחד 60 מ"ל מזרק עם הפתרון המקורי שימור הלבלב לעומת זאת למפעיל, מי יהיה להשתמש בו כדי למלא מוכן "רכש" בקבוקים בקטריולוגיה.
  3. לאחר בדיקה ויזואלית כדי לקבוע אם איבר מתאים בידוד איון (אם הלבלב נפגע במהלך הרכש או חריג מבחינה אנטומית, זה לא יכול לשמש לבידוד איון), המנתח יבקש מפעיל להכין collagenase. זכרו כי הזמן מחדש ההשעיה משתנה בין המותגים אנזים והרבה שונה.
  4. כאשר המנתח מוכן, להביא את פתרונות טיהור (בבטאדין, Fungizone / Cefazolin ו HBSS) לשולחן טיהור ויוצקים אותם לתוך המכולות המתאימות. המנתח מבצע טיהור הלבלב כביסה לרגע את הלבלב בכל פתרון טיהור. הלבלב ממוקם אז בצנצנת סטרילית קטן שבו יהיה שקל. לאחר משקל ברשומה אצווה, הלבלב ממוקם במחבת cannulation עם פתרון כמה לשימור.
  5. המנתח יחשוף באופן חלקי לחתוך את צינור הראשי cannulate כל חצי של הלבלב עם הצינורית. הצינורית יהיה מאובטח על ידי תפר. כדי perfuse הלבלב, תחילה להעביר אותו ליחידה זלוף ויוצקים את הפתרון האנזים לתוך הכיור. זמן זלוף סה"כ כ 10 דקות, 80 מ"מ כספית במשך 5 דקות, ולאחר מכן ב 180 מ"מ כספית במשך 5 דקות. לבלב נפוחה לאחר זלוף.
  6. הזז את הלבלב perfused לסיר cannulation, שבו רקמת שומן חיתוך מהלבלב בזהירות. ואז לחתוך את הלבלב לתוך 10-12 חתיכות להעביר Ricordi לשכת לעיכול.

3. הלבלב לעיכול

  1. כדי להתחיל צעד העיכול, להעביר את הלבלב אל לשכת Ricordi ריקה, להוסיף 2.5 מ"ל בבקבוקון של Pulmozyme, לשים על המסך (למנוע נתח גדול של גוש הרקמה קאמרית), לסגור את החדר, ולמלא את המערכת.
  2. התחל שאיבה הפתרון במשך 5 דקות. בעדינות את הסלע קאמרית כדי לפזר באופן שווה פתרון חמים לאורך כל הדרך. אחרי חמש דקות, בעדינות לנער את החדר עבור השלב העיכול כולו. שמירה על טמפרטורה ב 37 ˚ C.
  3. הסלע קאמרית בעדינות עד הטמפרטורה מגיעה ל 37 מעלות, ואז ללחוץ את החדר. קח דוגמה כל שתי דקות לזהות אם איים חינם נמצאים תחת היקף. תעדו את המידע הערכה איון בטבלה העיכול של הרשומה אצווה. המשך לעקוב אחר אחוז עד איים יש 50% מהם צף חופשי מבודד הפתרון.

4. רקמות אוסף

  1. לאחר 50% איים נמצאים חופשי בדגימות, עיכול הוא נעצר על ידי הוספת קר פתרון RPMI דילול במעגל. רקמות נאסף 500 מ"ל צינורות חרוטי טרום מלא 30 מ"ל אלבומין אדם. לאחר הצינורות הם הסתחררו, היניקה את supernatant לשטוף את הכדור עם פתרון לשטוף קר. ספין צינורות חרוטי ב 1100 סל"ד (סיבובים לדקה) עבור 1 דקה, 4 ˚ C.
  2. מערבבים את כל צינורות האיסוף תלוי עם רקמת לבלב מעוכל לתוך יחידה 500 מ"ל חרוטי. כאשר צינור מלא של רקמות שטף, ספין לחזור על התהליך עד שכל רקמת כביסה נחפף מספר פעמים. ספין זה צינור העברת רקמות לתוך צינור אחד מ"ל 250 חרוטי. תביאו את נפח של עד 250 מ"ל עםM199 פתרון כביסה בתוספת HA ולהתכונן הדגימה.
  3. קח דוגמה 1 מ"ל עם טפטפת ולהוסיף צינור מ"ל 15 חרוטי מראש מלא 9 מ"ל של תמיסת לשטוף. ואז לערבב ידי צינור חרוטי היפוך בעדינות 15 מ"ל ומתוך זה, מתוך מדגם 1ml ישירות לתוך צלחת רשת סופר. ספירת תאים, לחשב את מספר הסלולרי באמצעות גורם לדילול של 2500 (10x250).
  4. ספין הצינור 250 מ"ל חרוטי ולהוסיף 150 מ"ל של UW (אוניברסיטת ויסקונסין) פתרון שבדרך כלל להשתמש לשימור איברים. כאשר UW הוא הוסיף, לערבב את ההשעיה התא ביסודיות בעזרת פיפטה. שיא ולתקשר למפעיל טיהור הזמן להתחיל UW. השאירו את הצינור (ים) על הקרח מערבולת מדי פעם. עכשיו איים ניתן מטוהרים נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם מגוון גורמים המשפיעים על התוצאה בידוד 9,10. ביניהם, עיכול של רקמת הלבלב תפקיד בולט. בהתבסס על הניסיון שלנו איון אדם בבידוד, סיכמנו הבאים נקודות קריטיות, אשר עלול להשפיע על איכות תשואה איון ו.

  1. זמן עיכול שונה, כאשר סוגים שונים של אנזימים מנוצלים.
  2. ברגע 40-50% של איים המופרדים לגמרי מן הרקמה acinar, העיכול יש להפסיק באופן מיידי על ידי הוספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

נתמכים על ידי מימון מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת קרח גרוס (Ice Slush Machine)ציודTaylor CompanyK4036546הכנת קרח סטרילי
צנטריפוגהציודBeckman Coulter Inc.424803
מיקרוסקופ הפוך MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1ציודLeica Microsystems4103
צלחת תרבית תאים עם רשת של 2 mmציודNalge Nunc international174926ספירת איים (islets)
אמבט מים דיגיטלי EX7ציודNesLab105361058
מד חוםציודIBI:IR60444
מאזניים MonoBloc Balance AB 104-SציודMettler Toledo1119430864מדידת משקל הלבלב
בקר מהירות MasterFlex II Speed ControllerציודCole-ParmerJ00006445כיוון מהירות הזרימה במהלך העיכול
מערכת תצפית דיגיטלית Digital Sight DS L1ציודNikon Instruments217267
יחידת פרפוזיהציודCustom Maden/a
קירור ליחידת הפרפוזיהציודFisher Scientific3013P
תא ריקורדי (Ricordi Chamber)ציודUniversity of Miamin/a
תמיסת דילול RPMIריאגנטMediatech, Inc.99783024
תמיסת אוניברסיטת ויסকনסין (UW)ריאגנטDURAMED1000-46-06
תמיסת מלחים עם בופר של Hank’s (HBSS)ריאגנטMediatech, Inc.99-597-CM
אלבומין אנושי 25%ריאגנטGRIFOLSNDC 61953-0002-2
מדיום M199 (תמיסת שטיפה)ריאגנטMediatech, Inc.99-784-CM
Collagenase NB1 בדרגת GMPריאגנטSERVA ElectrophoresisN0002937
Neutral Protease NB1 בדרגת GMPריאגנטSERVA ElectrophoresisN0002936
בטאדין (Betadine)ריאגנטCardinal Health29906-004
צפזולין (Cefazolin)ריאגנטWest-Ward PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
דיתיזון (Dithizone)ריאגנטSigma-AldrichD5130

מקורות

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RicordiRPMIUW
בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.