פרוצדורה זו משתמשת ערוץ תכלת המופעל אצות תא ספציפי כלי הביטוי הגנטי לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם להבזקי האור בצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הזחלים. טכניקה זו היא זולה וקלה לשימוש חלופה גירוי יניקה אלקטרודה ללימודי פיזיולוגיה הסינפטי מחקר ומעבדות הוראה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים
במאמר זה
סיכום
פרוטוקול
חלק 1: טיפול בבעלי חיים וחוצה גנטי
- שמור כטב"מ-ChR2 ו-OK371 GAL4 קווי לטוס בבקבוקים נפרד המכיל התקשורת לטוס תקן 8.
- איסוף בתולות OK371-GAL4 קווי לעוף הזכרים של כטב"מים-ChR2 הקווים.
- שים הן זכרים ונקבות בבקבוקון המכיל התקשורת לטוס רגיל מעורבב עם 1 מ"מ כל טרנס הרשתית (ATR). מזון ATR צריכה להיעשות על ידי הראשון קבוע ההיתוך התקשורת לטוס במיקרוגל למשך דקה 1 ~. לאחר מותך, להתקרר למשך כ 30 שניות עד דקה אחת ולאחר מכן להוסיף 100 μl של 100 mM ATR ב ETOH 100 מ"ל 10% עבור כל התקשורת לעוף. צלוחיות מקום על הקרח, אז חנות באזור כהה 4 ° C.
- בואו להזדווג הזבובים להטיל את הביצים באזור חשוך בשעה 22-25 ° C.
- חכה 3-4 ימים עד 3 instar הזחלים גלויים, בנקודה זו, תשליך זבובים בוגרים.
חלק 2: הגדרת Rig
- צרף כל עין 10x לנתח היקף היצירה (במקרה שלנו, של Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, ניו יורק), אל מקור אור LED כחולות עם גוף הקירור (Thor מעבדות, www.thorlabs.com, ניוטון, NJ ). צרף בסיס מגנטי עם פירסום מהדק. כיסוי גוף הקירור עם מגן הארקה חשמלית כדי להפחית את הרעש החשמלי שנוצר על ידי מקור האור.
- מניחים בסיס מגנטי עם מקור אור על שולחן אוויר של electrophysiology מעטה.
- חיבור מקור האור לשלוט מעגל ומתחברים מעגל בקרה למקור מתח חיצוני (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, קולורדו ספרינגס, CO).
- תן 1-5 פולסים V לשלוט מעגל להפעיל אור כחול.
- התאם בסיס מגנטי מקור אור עד אלומת אור כחול הוא התמקד באזור להיות כבוש על ידי לנתיחה הזחל.
חלק 3: Dissection
- Six פלייס 0.1 מ"מ סיכות חרקים לתוך הרצפה של צלחת sylgard מרופד.
- הסרת 3 rd הזחלים instar מהתקשורת מזון ומקום לתוך כל צלחת פלסטיק-פטרי.
- יש לשטוף את הזחלים עם מלח כדי להסיר את המזון.
- המקום זחלים ב לנתח צלחת ליד סיכות משך ולהוסיף מלח לרמה ½.
- אוריינט הזחלים, כך שאתה יכול לראות שני צינורות כסופים (קנה הנשימה) פועל על פני השטח הגבי של החיה.
- הכנס פין גדול ישירות לתוך הזנב בין צינורות לקנה הנשימה. החזק את הזחלים למטה במקום סיכה גדולה נוספת לתוך הראש שלה, להיות בטוח כדי למתוח את הגוף החוצה לאורכו.
- לעשות חתך קטן ליד הזנב, ולהמשיך אותו אורך הגוף. ודא טיפים של המספריים גדלים כדי לא בטעות לחתוך עצבים הגחון ו / או קיר שרירי הגוף.
- מקום ארבע סיכות על ארבע פינות של החיה עכשיו הבטן פתוחה. הגדר אותם לתוך התבשיל לנתח כדי פילה החי. הכנה פין לימד החוצה.
- בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את האומץ של החיה, קנה הנשימה וגורמים שומן.
- שוטפים את הכנה עם תמיסת מלח.
- אתר את האונות הקדמיות (כפי שניתן לראות באיור) ו הגנגליון הגחון של הכנה.
- באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך בזהירות הגנגליון הגחון ממש מאחורי האונות הקדמיות.
חלק 4: הקלטה שרירים וגירוי אור כחול
- משוך אלקטרודה 10-20 μω באמצעות אלקטרודה חולץ אלקטרוניים (סאטר מכשירים).
- מלאו את האלקטרודה משך עם 3M KCl.
- המקום מלא בעל אלקטרודה אלקטרודה אלקטרודה קצה לתמרן עם micromanipulator ליד הכנה הזחל תחת מיקרוסקופ לנתח על electrophysiology מעטה.
- זיהוי שרירים 6 (M6) כל גוף במגזר הקיר (איור).
- בזהירות להכניס אלקטרודה לתוך M6 ולצפות עבור hyperpolarization מהירה. מנוחה שרירים הפוטנציאלים הממברנה צריך להיות בכל מקום מ -30 mV ל -70 mV.
- התאם את האור הכחול, כך הכנה גזור מרוכז קרן אור.
- תן 20-100 פעימות ms מתח לשלוט מעגל. בהדרגה להגדיל את מתח המסופק לשלוט מעגל. Watch עבור פוטנציאלים מעוררים צומת בתא השריר (איור 1 ב).
נציג תוצאות:
איור 1 א מראה סכימטי של הגדרת הקלטה הכנה נשלף. 1B איור מראה אופייני EJP עורר על ידי להבזקי האור קצר. משרעת EJP המוצג הוא סיכם משרעת משני הנוירונים המנוע ידוע כאחד innervate M6. לעוצמות אור תחתון בלבד מופעל יחידה מוטורית (מידע לא מוצג).
איור 1: סכמטית) כללי של המתקן הקלטה תאיים עם LED כחול. המוח (בר) מוסר לעכב פעילות קצבית ב הגנגליון הגחון (VG). ChR2 מתבטא הנוירונים המנוע באמצעות מערכת GAL4-כטב"מ. ב) הקלטה תאיים מ שריר M6. 40 ms כחול להבזקי האור (ב 127 μW / מ"מ 2) אמין לעורר פוטנציאלים סינפטיים גדול (כוכביות) ב M6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים קריטיים לערב גם את לנתיחה הראשוני של הכניסה לתאי שריר. אם עצבים נחתכים או שריר פגום במהלך הניתוח הראשוני קשה כדי להמשיך את שאר הניסוי. במהלך הניתוח, יש להיזהר מאוד זווית לנתח מספריים כלפי מעלה ככל האפשר במהלך חתך הגבי. במהלך השלב המכריע השני, נכנסים לתא השריר, יש לצפות hyperpolarization עבר ~ 30 mV. ערכים מעל -30 mV עולה כי האלקטרודה היא גם לא נכונה בתוך תא שריר או תא בריא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו שום ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים RO1GM-33205 ו MH-LC עד 067,284 גריפית על ידי מלגה לתואר ראשון באוניברסיטת ברנדייס בקיץ מחקר NJ הורנשטיין. ניסויים ראשוניים של טכניקה זו בוצעו בשלב המעבדה לביולוגיה ימית במסגרת מערכות עצביות 2008 ובקיץ התנהגות כמובן (NIMH מענק: R25 MH059472) ב וודס הול, מסצ'וסטס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| סיכות מינוטנס (Minutens Pins) | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| צלחת נתיחה | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| מגבר תוך-תאי וראש-במה של Neuroprobe | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| מערכת לרכישת נתונים Powerlab 4/30 |  ADInstruments | www.adinstruments.com | |
| מעורר צמיחה לדשא | טכנולוגיות דשא | www.grasstechnologies.com | |
| מחשב שולחני | Dell | www.dell.com | |
| מיקרוסקופ לדיסקציה | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| מקור אור | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| מצע גידול לזבובים | |||
| all-trans-retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 זבובים | מרכז המאגרים של בלומינגטון (Bloomington Stock Center) | ||
| UAS-ChR2 זבובים | מעבדה של פיאלה, מעבדה של גריפית' | ||
| מעגל בקר LED | נבנה במעבדת Griffith | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com מורכב מ: 1. Buck Puck של 200 mA 2. נורית LED כחולה 3. חוט מבודד 4. לוחבדיקות למעגלים (bread board) | |
| גוף קירור ל-LED | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| שולחן אוויר | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| כלוב פראדיי | נבנה במעבדת Griffith | ||
| מיקרו-מניפולטור Leica Leitz M | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| מחזיק אלקטרודה | Axon Instruments | www.axon.com | |
| זכוכית בורוסיליקט | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| מכשיר למשיכת אלקטרודות | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 תמיסת מלחים עם 0.8mM Ca2+ | תכנים (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl22סוכרוז:4:115 NaHCO₃310 טרהלוז: 5 HEPES | ||
| כלי מיקרו-דיסקציה | Fine Science Tools | www.finescience.com |
מקורות
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
