לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המוח פרופר החדר היווצרות במהלך התפתחות המוח העוברי נדרש תפקוד המוח הנורמלי. חדרי המוח הינם חללים שמור ביותר בתוך המוח, כי הם מלאות בנוזל השדרה. בשנת דג הזברה, לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium עובר סדרה של המגבלות וקפלי בזמן שהוא מתמלא נוזל וכתוצאה מכך היווצרות החדר המוח. על מנת להבין את תהליך היווצרות החדר, ואת השינויים בצורת neuroepithelial המתרחשות בעת ובעונה אחת, אנחנו צריכים דרך לחזות את החלל החדר לעומת רקמת המוח. עם זאת, טבעו של עוברי דג הזברה שקוף מקשה להבדיל בין רקמות מחלל החדר. לכן, פיתחנו החדר המוח הזרקת טכניקה שבה שטח החדר מתמלא פלורסנט לצבוע הדמיה על ידי brightfield וכן במיקרוסקופ פלואורסצנטי. Brightfield ותמונות פלורסנט מעובדים אז גבי Photoshop. טכניקה זו מאפשרת להדמיה של מרחב החדר עם צבע פלואורסצנטי, בהשוואה בצורת neuroepithelium בתמונה brightfield. החדר המוח הזרקת דג הזברה יכול להיות מועסק מן ההפריה 18 שעות הודעה דרך שלבים מוקדם הזחל. השתמשנו בטכניקה זו בהרחבה, כמו גם באפיון המורפוגנזה מוח מוטציות (1-3) במחקרים שלנו, של היווצרות המוח החדר ואת המורפוגנזה.
פרוטוקול
פרוטוקול
חלק 1: הכנת microinjection
- היכונו הזריקה ידי משיכת מחטים נימי סאטר חולץ באמצעות מכשירים מחט.
- מלאו את המחט עם פלורסנט לצבוע (כגון טקסס האדום dextran).
- הר מחט במנגנון micromanipulator ו microinjection.
- חותכים את המחט לגודל המתאים בזווית כדי ליצור קצה משופעים.
- מדוד את גוד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להזריק צבע פלואורסצנטי (טקסס האדום dextran) לתוך החדרים במוח דג הזברה מתפתח. שיטה זו משמשת כדי להמחיש את המוח בחלל החדר בניגוד neuroepithelium שמסביב שימושי מאוד לקביעת צורה של מרחב החדר, כמו גם את הצורה של רקמת המוח שמסביב. זה מאפשר לנו להבין טוב יותר את התהליך של היווצרות המוח החדר ואת המורפוגנזה המוח במשך הזמן העובר לחיות. טכניקה זו היא כלי מצוין ללימוד החדר המוח היווצרות פגמים לאפיון ראשוני המחקר של מוטנטים המורפוגנזה המוח.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
המחברים מבקשים להודות לאורה Lowery אן שפיתח את הטכניקה הזו במעבדה. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. ג'ניפר Gutzman נתמך על ידי מענק CSBi / מרק דוקטורט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| פינצטה | כלי | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| צינוריות קפילריות (מחטים) | כלים | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| צלחות מצופות אגרוז | כלים | צלחות אגרוז (Seakem GTG; Lonza) (Corning) | צלוחות אגרוז (50027) (430166) | יש להכין את האגרוז בעומק של כ-2-3 מ"מ בתוך הצלחת, בהתאם לשלב ההתפתחותי של העובר שאתם מזריקים. |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי | מיקרוסקופ | Carl Zeiss, Inc. | ||
| מצלמת מיקרוסקופ בעלת יכולות פלואורסצנציה ובתוספת תוכנה ללכידת תמונות | כלים | |||
| 1-200 μ טיפי פפיטה | כלים | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | אלו הם הגדלים המדויקים ליצירת החורים באגרוז, כך שהעוברים יתאימו להם באופן מושלם. |
| פוטושופ (Photoshop) | ניתוח תמונות | Adobe | ||
| לולאת עובר | כלים | ניתן להכין אותם באופן עצמאי באמצעות פיפטה מזכוכית ושערה או חוט דיג, ולאטום אותם בעזרת שעוות דבורים. | ||
| מיקרו-מזרק | כלים | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| שולף מחטים | כלים | Sutter Instrument Co. | הגדרות (חום 785, מתיחה 70, מהירות 40, זמן 70). | |
| מיקרו-מניפולטור | כלים | Narishige International | ||
| צבע פלואורסצנטי Texas-Red Dextran 70,000MW | ריאגנט | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | משקלים מולקולריים אחרים זמינים במידה ונדרש. |
| טריקאין (3-אמינובנזואית חומצה אתיל אסתר) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| מדיום לעוברים | ריאגנט | על פי Westerfield (5) |
מקורות
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
