לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המוח פרופר החדר היווצרות במהלך התפתחות המוח העוברי נדרש תפקוד המוח הנורמלי. חדרי המוח הינם חללים שמור ביותר בתוך המוח, כי הם מלאות בנוזל השדרה. בשנת דג הזברה, לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium עובר סדרה של המגבלות וקפלי בזמן שהוא מתמלא נוזל וכתוצאה מכך היווצרות החדר המוח. על מנת להבין את תהליך היווצרות החדר, ואת השינויים בצורת neuroepithelial המתרחשות בעת ובעונה אחת, אנחנו צריכים דרך לחזות את החלל החדר לעומת רקמת המוח. עם זאת, טבעו של עוברי דג הזברה שקוף מקשה להבדיל בין רקמות מחלל החדר. לכן, פיתחנו החדר המוח הזרקת טכניקה שבה שטח החדר מתמלא פלורסנט לצבוע הדמיה על ידי brightfield וכן במיקרוסקופ פלואורסצנטי. Brightfield ותמונות פלורסנט מעובדים אז גבי Photoshop. טכניקה זו מאפשרת להדמיה של מרחב החדר עם צבע פלואורסצנטי, בהשוואה בצורת neuroepithelium בתמונה brightfield. החדר המוח הזרקת דג הזברה יכול להיות מועסק מן ההפריה 18 שעות הודעה דרך שלבים מוקדם הזחל. השתמשנו בטכניקה זו בהרחבה, כמו גם באפיון המורפוגנזה מוח מוטציות (1-3) במחקרים שלנו, של היווצרות המוח החדר ואת המורפוגנזה.
פרוטוקול
פרוטוקול
חלק 1: הכנת microinjection
- היכונו הזריקה ידי משיכת מחטים נימי סאטר חולץ באמצעות מכשירים מחט.
- מלאו את המחט עם פלורסנט לצבוע (כגון טקסס האדום dextran).
- הר מחט במנגנון micromanipulator ו microinjection.
- חותכים את המחט לגודל המתאים בזווית כדי ליצור קצה משופעים.
- מדוד את גודל טיפה ולבדוק כי הוא בין 1-2nl לכל זריקה בשמן.
חלק 2: הכנת עוברים
- להזריק את העוברים 30 דקות מוקדם יותר בשלב של עניין. לדוגמה, כדי ללמוד את החדרים ב 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), להזריק את העוברים על hpf 23.5. שלב את העוברים על פי קימל et al. (4).
- תחת stereomicroscope, בזהירות להסיר את סיסית מן העוברים באמצעות מלקחיים.
- בעזרת צלחת פלסטיק מצופה agarose 1%, חורים agarose עם טיפ 100-200 פלסטיק פיפטה μl. הסר בזהירות את אטמי agarose מן החורים באמצעות מלקחיים.
- העברת העוברים בתקשורת העובר לתוך צלחת agarose עם חורים.
- הוסף tricaine (שנעשו על פי Westerfield (5)) בתקשורת להרדים את העוברים ולמנוע תנועה במהלך הניסוי.
- בעדינות במקום זנב העובר לתוך החור, לכוון אותו כך מנגנון הזרקת נמצא בצד האחורי של העובר.
חלק 3: הזרקת החדר המוח
- כדי להזריק את החדר המוח, לסדר את ההתקנה המיקרומניפולציה כך את קצה המחט באותו שדה הראייה כפי העובר על מתח גבוה.
- בזהירות את המחט דרך roofplate הדק של למוח האחורי האחורי רק כדי hingepoint r0/r1 בלי לפגוע ברקמת המוח להלן.
- הזרק מספיק לצבוע לחלוטין למלא את החדרים. זה עלול לקחת כמה זריקות כדי למלא את חלל החדר, תלוי בשלב של העובר.
חלק 4: הדמיה
- שימוש נקי של 1% agarose מצופה צלחת, חורים חדשים בצלחת, הסר את המצתים, ולהוסיף tricaine להרדים את העוברים ולמנוע תנועה.
- מניחים את הזנב של העובר החדר, מוזרק לתוך החור בעמדה עבור תמונה הגבי.
- קחו את התמונה באמצעות האור המועבר.
- זה קריטי מאוד שלא להזיז את העובר או מיקרוסקופ.
- שינוי ההגדרות על המיקרוסקופ לקחת תמונה עם אור ניאון.
- שנה את מיקום העובר לקחת תמונות לרוחב עם האור הן מועבר אור ניאון.
- שמור את התמונות כקובצי TIFF עבור עיבוד התמונה Photoshop.
חלק 5: עיבוד תמונה
- כדי לעבד את התמונות ב-Photoshop, פתחו את האור המועבר ותמונות אור ניאון של העובר אותו לקח באותה תנוחה. הקפד כל ההגדרות זהים עבור כל תמונה.
- גרור תמונה פלורסנט שלך על התמונה האור המועבר ולסדר אותן בדיוק.
- עם התמונה פלורסנט שנבחר, בחר "תמונה", "התאמות", ואז "החלף צבע" וגם לשנות את הרקע משחור ללבן.
- בחלון "החלף צבע" להתאים את גורם "הערפול" ימינה עד התמונות פלורסנט נראה אחיד בצבע.
- בחלון "שכבות", בחר "הכפל" להציג את התמונות כיסוי. תמונת חלל החדר שלך צריך להתאים את התמונה בדיוק האור המועבר.
- שמור את הקובץ וחזור על כל תמונות אחרות.
תוצאות נציג / תוצאה
פרופר תמונות הזרקת החדר מוצגים באיור 1 לוחות לספירה, ואילו דוגמה תמונות הזרקה שגויה מוצגים EH. זריקות נכונה יש קצוות חדים ולא מפוזר צבע. הזרקה שגויה, אשר מתרחשת כאשר המחט מוחדרת עמוק מדי לתוך החדר והוא פוגע ברקמת המוח להלן, יכול לגרום לצבוע שמחוץ לעין של מרחב החדר ועל החלמון.
באיור 1. החדר זריקות של 25 עוברי hpf סוג בר. (AD) שיטת הזרקה נכונה (EH) שיטת הזרקה שגויה מוצגים כדוגמאות. (A, E) תמונות brightfield הגב עם תמונות פלורסנט המקביל (B, F) את השכבה של תמונות פלורסנט brightfield (C, G) עבור שיטות הזרקת והלא מדויקות המוצג. החצים מצביעים על אזורים בהם לצבוע הלך מעבר בחלל החדר המוח עקב זריקה החדר נכונה (ראה "פתרון בעיות"). Anterior היא שמאלה כל התמונות.
פתרון בעיות:
| בעיה | לגרום | תרופה |
| אתה מועך את העובר עם המחט. | מחט שלך בוטה מדי או טיפ גדול מדי. | התחל עם מחט חדשה לא לשבור אותו הרחק מאחור. שפוע מחט שלך כדי לעשות את זה חד כמו מחט מזרק. |
| הצבע הוא לאורך העובר ואת החלמון (ראה איור 1E-H). | מחט שלך עבר הרקמה ולא להישאר בחלל החדר. | מחט שלך עשוי להיות לא חד מספיק, אז אתה לא מצליח לשלוט על מהירות של לנקב. |
| צבע הוא חלש מדי או לא forebrain. | לא להשתמש בלחץ גבוה מספיק עבור הזריקה, או מחט שלך לא היה רחוק מספיק כדי להגיע הקדמי forebrain כאשר הזריקו את צבען. | להגביר את הלחץ הזרקה או מקום מחט שלך מעט קדמית יותר במהלך הזריקה. אתה יכול לשים את המחט דרך גבול למוח האחורי, המוח התיכון אם ביתר פירוט נדרש forebrain. אתה יכול גם פשוט לחכות קצת בשביל הצבע כדי לפזר עוד לפני הדמיה. |
| תמונות פלורסנט שלך חשוך מסביב לקצוות לאחר החלפת צבע Photoshop. | שכחת לשנות את ההגדרה "הערפול" בחלון להחליף צבע. | הזיזו את "הערפול" כל הדרך ימינה בחלון להחליף צבע. |
| המחט לא לנקב את roofplate למוח האחורי. | מחט שלך לא נחתך כראוי. | הפוך את מחט חדשה. אם אתה עושה הרבה זריקות ייתכן שתצטרך מחטים כמה שהם יכולים לקבל משעמם. |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להזריק צבע פלואורסצנטי (טקסס האדום dextran) לתוך החדרים במוח דג הזברה מתפתח. שיטה זו משמשת כדי להמחיש את המוח בחלל החדר בניגוד neuroepithelium שמסביב שימושי מאוד לקביעת צורה של מרחב החדר, כמו גם את הצורה של רקמת המוח שמסביב. זה מאפשר לנו להבין טוב יותר את התהליך של היווצרות המוח החדר ואת המורפוגנזה המוח במשך הזמן העובר לחיות. טכניקה זו היא כלי מצוין ללימוד החדר המוח היווצרות פגמים לאפיון ראשוני המחקר של מוטנטים המורפוגנזה המוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
המחברים מבקשים להודות לאורה Lowery אן שפיתח את הטכניקה הזו במעבדה. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. ג'ניפר Gutzman נתמך על ידי מענק CSBi / מרק דוקטורט.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| פינצטה | כלי | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| צינוריות קפילריות (מחטים) | כלים | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| צלחות מצופות אגרוז | כלים | צלחות אגרוז (Seakem GTG; Lonza) (Corning) | צלוחות אגרוז (50027) (430166) | יש להכין את האגרוז בעומק של כ-2-3 מ"מ בתוך הצלחת, בהתאם לשלב ההתפתחותי של העובר שאתם מזריקים. |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי | מיקרוסקופ | Carl Zeiss, Inc. | ||
| מצלמת מיקרוסקופ בעלת יכולות פלואורסצנציה ובתוספת תוכנה ללכידת תמונות | כלים | |||
| 1-200 μ טיפי פפיטה | כלים | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | אלו הם הגדלים המדויקים ליצירת החורים באגרוז, כך שהעוברים יתאימו להם באופן מושלם. |
| פוטושופ (Photoshop) | ניתוח תמונות | Adobe | ||
| לולאת עובר | כלים | ניתן להכין אותם באופן עצמאי באמצעות פיפטה מזכוכית ושערה או חוט דיג, ולאטום אותם בעזרת שעוות דבורים. | ||
| מיקרו-מזרק | כלים | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| שולף מחטים | כלים | Sutter Instrument Co. | הגדרות (חום 785, מתיחה 70, מהירות 40, זמן 70). | |
| מיקרו-מניפולטור | כלים | Narishige International | ||
| צבע פלואורסצנטי Texas-Red Dextran 70,000MW | ריאגנט | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | משקלים מולקולריים אחרים זמינים במידה ונדרש. |
| טריקאין (3-אמינובנזואית חומצה אתיל אסתר) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| מדיום לעוברים | ריאגנט | על פי Westerfield (5) |
מקורות
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
