Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS
במאמר זה
סיכום
תקציר
הכנת תא בודד השעיות מרקמות היא תנאי חשוב ניסויים רבים במחקר הסלולר. תהליך dissociating איברים שלם דורש פרמטרים ספציפיים על מנת לקבל מספר גבוה של תאים חיים בצורה לשחזור. Dissociator gentleMACS מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. המכשיר מכיל מתוכנתים מראש הגדרות מותאמות דיסוציאציה היעילה אך עדין של מגוון רחב של סוגי רקמות, כולל הריאות העכבר. בפרסום זה השימוש Dissociator gentleMACS על רקמת הריאה נגזר עכברים מודגם.
פרוטוקול
כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית.
1. חומרים
- HEPES חיץ: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2)
- Collagenase פתרון D: collagenase D: 100 מ"ג / מ"ל (collagenase D> 0.15 U / מ"ג), ב HEPES חיץ
- DNase פתרון אני: 20,000 U / mL DNase אני
- PBS חוצץ ב-pH 7.2
- PEB חיץ: 1 חלק BSA במלאי פתרון ב 20 חלקים autoMACS פתרון שטיפה
- רקמות: ריאות הנגזרות 6 / 7 שבוע הישן נקבה בוגרת BALB / C העכבר, ללא איברים סמוכים.
- אופציונלי: microbeads CD11c, MACS עמודות MS, MACS מפריד עבור בידוד של תאים דנדריטים מן ההשעיה ריאות תא בודד העכבר
2. Dissociating רקמת הריאה
- יש לשטוף את רקמת בצלחת פטרי המכילות PBS להסיר אריתרוציטים.
- העברה מרבי של רקמת הריאה עד 450 מ"ג Tube gentleMACS C המכיל 4.9 מ"ל HEPES חיץ.
- הוספת 100 μL פתרון D collagenase לריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל collagenase ד
- הוסף 10 פתרון μL DNase אני בעד רקמה 150 מ"ג (הריכוז הסופי של 40 U / ml DNase אני) או 20 μL DNase אני עבור רקמת הריאה 150-450 מ"ג (הריכוז הסופי של 80 U / mL DNase אני).
- חזק לסגור את Tube C וצרף אותו על Dissociator gentleMACS. ואז להפעיל את התוכנית "m_lung_01".
- דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות עם סיבוב אוטומטי או ידני להפוך כל 5 דקות.
- חזור מדגם Dissociator gentleMACS ולהפעיל את התוכנית "m_lung_02".
3. סינון
- הכן צינורית 50 מ"ל לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת מכסה עם מסננת רשת 70 מיקרומטר התא.
- לאחר תוכנית second gentleMACS מסתיים, בהתאם לחלוקת חומר מדגם בצינור, ייתכן צנטריפוגות הצינור קצר כדי לאסוף את החומר מדגם בחלק התחתון של הצינור.
- הסר את התאים באמצעות כובע חתום של מחצה התחתית C באמצעות קצה מתאים 1000 פיפטה μl ולהחיל אותן על מסננת את התא.
- שטפו את מסננת תא עם חיץ HEPES 5 מ"ל ב RT.
- צנטריפוגה את התאים גלולה בצינור 50 מ"ל ב 300xg במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה בהיקף הרצוי מאגר PEB.
חלק 4: תוצאות נציג:
באיור 1. הביאה ריאות דיסוציאציה עם ™ gentleMACS Dissociator בתאים קיימא 92%. תאים מתים היו מוכתמים fluorescently עם יודיד propidium (PI) (העלילה נקודה הנכונה; העלילה נקודה שמאל: לא מכתים PI).
איור 2. דיסוציאציה של רקמת הריאה באמצעות העכבר את התוצאות Dissociator gentleMACS באחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. נגזר תא בודד השעיות הוכתמו CD45-PE ו-CD146 FITC או CD31-FITC ונותחו על ידי cytometry הזרימה.
איור 3. תא בודד ההשעיה נבעה רקמת הריאה העכבר היה מוכתם CD11c-FITC ואנטי mPDCA-1-APC לאתר עכבר CD11c נמוך מ-PDCA-1 + DCs plasmacytoid כמו גם תאים גבוה CD11c.
איור 4. והעשרה של תאים דנדריטיים באמצעות microbeads CD11c, מפריד MiniMACS ושני טורים MS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה, אנו מציגים שיטה חדשה דיסוציאציה של רקמת הריאה העכבר. אנו מראים כי שילוב של טיפול מכני האנזימטית של רקמת הריאה הניבו אחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. באופן ספציפי, התפוררות מכנית של רקמת הושגה על ידי Dissociator gentleMACS. C צינורות gentleMACS כוללים הרוטור - מערכת הסטטור, אשר מנתק רקמות בצורה עדינה. הליך זה נשלט על ידי הגדרות התוכנית של המכשיר. ההגדרות היו אופטימיזציה כדי להשיג תשואה גבוהה הכדאיות של תאים. נגזר תא בודד השעיות הוכתמו CD45-PE ו-CD146 FITC או C...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים הם עובדים של חברת Miltenyi Biotec GmbH, המייצרת את המכשיר המשמש במאמר זה.
תודות
הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנות C (C Tubes) | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx |
| gentleMACS™ ערכה להתחלה | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-235 | <הקישור הוא ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ מסובב מבחנות | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| autoMACS™ תמיסת שטיפה | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx |
| MACS® תמיסת מלאי BSA | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-091-376 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx |
| CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-052-001 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx |
| CD11c-FITC, CD11c-PE | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-092-026130-091-830 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx |
| Anti-mPDCA-1-APC | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-091-963 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx |
| CD146-FITC | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-092-026 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx |
| CD45-PE | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-091-610 | <קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx |
| תמיסת פרופידיום יודאיד | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
| טיפי פ pipette עם הגעה ארוכה Art 1000 | Molecular BioProducts | מספר הזמנה 2079 | http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים במנדף זרימה למינרית. 1. חומרים בופר HEPES: (10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2) תמיסת Collagenase D: Collagenase D בריכוז 100 mg/mL (Collagenase D > 0.15 U/mg), בבופר HEPES תמיסת DNase I: 20,000 U/mL DNase I בופר PBS ב-pH 7.2 בופר PEB: חלק אחד של תמיסת מקור BSA ב-20 חלקים של autoMACS Rinsing Solution רקמה: ריאה המופקת מעכברת נקבה בוגרת מסוג BALB/C בת 6/7 שבועות, ללא איברים סמוכים. אופציונלי: CD11c MicroBeads, עמודי MACS MS, ו-MACS Separator לצורך בידוד תאים דנדריטיים מתמיסת תאים בודדים של ריאת עכבר. 2. דיסוציאציה של רקמת הריאה שטוף את הרקמה בצלחת פטרי המכילה PBS כדי להסיר אריתרוציטים. העבר עד 450 מ"ג של רקמת ריאה לתוך gentleMACS C Tube המכיל 4.9 מ"ל בופר HEPES. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת Collagenase D עד לריכוז סופי של 2 mg/ml Collagenase D. הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת DNase I עבור עד 150 מ"ג רקמה (ריכוז סופי של 40 U/ml DNase I), או 20 מיקרוליטר DNase I עבור 150-450 מ"ג רקמת ריאה (ריכוז סופי של 80 U/mL DNase I). סגור היטב את ה-C Tube וחבר אותו למכשיר gentleMACS Dissociator. לאחר מכן, הפעל את התוכנית "m_lung_01". דגור במשך 30 דקות ב-37°C עם סיבוב אוטומטי או על ידי סיבוב ידני מדי 5 דקות. החזר את הדגימה למכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_lung_02". 3. סינון הכן מבחנה של 50 מ"ל לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת הפקק במסנן תאים (cell strainer) בעל רשת של 70 מיקרון. עם סיום תוכנית ה-gentleMACS השנייה, בהתאם להתפלגות חומר הדגימה במבחנה, ניתן לצנטריפוג את המבחנה לזמן קצר כדי לרכז את חומר הדגימה בתחתית המבחנה. הוצא את התאים דרך הפקק האטום במבנה הספטום של ה-C Tube באמצעות טיפ פפיטה מתאים של 1000 מיקרוליטר והעבר אותם למסנן התאים. שטוף את מסנן התאים עם 5 מ"ל בופר HEPES בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוג את התאים ליצירת משקע (pellet) במבחנה של 50 מ"ל ב-300xg למשך 10 דקות. שאב את הנוזל העליון (supernatant) והשב את משקע התאים לתמיסה בנפח הרצוי של בופר PEB. חלק 4: תוצאים מייצגים: איור 1. דיסוציאציה של ריאה באמצעות gentleMACS™ Dissociator הניבה 92% תאים חיוניים. תאים מתים נצבעו פלואורסצנטית ב-propidium iodide (PI) (תרשים פיזור ימני; תרשים פיזור שמאלי: ללא צביעת PI). איור 2. דיסוציאציה של רקמת ריאה של עכבר באמצעות gentleMACS Dissociator מניבה אחוז גבוה של לוקוציטים ותאי אנדותל חיוניים. תמיסות התאים הבודדים שהופקו נצבעו ב-CD45-PE ו-CD146-FITC או ב-CD31-FITC ונחקרו באמצעות ציטומטריית זרימה. איור 3. תמיסת תאים בודדים שהופקה מרקמת ריאה של עכבר נצבעה ב-CD11c-FITC וב-Anti-mPDCA-1-APC כדי לזהות תאי DC פלסמציטואידיים מסוג CD11clow m-PDCA-1+ של עכבר, וכן תאים מסוג CD11chigh. איור 4. העשרה של תאים דנדריטיים באמצעות CD11c MicroBeads, MiniMACS Separator ושני עמודי MS.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
מקורות
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
