Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתוך מערכת העצבים, מאות סוגי תאים עצביים ועל גליה תוארו. כל סוג תא מסוים במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של פני השטח מולקולות התא, או גורמים המולקולרית, שבאמצעותה ניתן זוהו ואופיינו. נכון לעכשיו, זיהוי תאים חזקים טכנולוגיות הפרדה דורשים תא בודד ההכנות להיות שנוצר ובמקביל הגבלת מוות של תאים והרס של חלבון משטח אופייני. Dissociator gentleMACS, כאשר בשילוב עם טריפסין או papain מבוססי ערכות דיסוציאציה, יכול ביעילות ובעדינות לנתק את רקמת המוח תוך שמירה epitopes אנטיגן והגבלת אובדן התא. הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מושגת באמצעות צינורות C, אופטימיזציה, תוכניות מראש gentleMACS. לאחר שנוצר, תא בודד השעיות יכולים להיות מטופלים עם conjugates חד שבטיים כמו אנטי Prominin microbeads-1, אשר לזהות אבות עצביים, או מטוהרים נוסף באמצעות חרוזים המיאלין הסרת.
פרוטוקול
כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית.
1. חומרים
- רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P) (רכיבים: פתרון 1,2, 3 ו 4, מאגר אחסון)
- טרום ההפרדה מסננים
- (אופציונאלי) המיאלין חרוזים להסרת
- בטא mercaptoethanol
- gentleMACS Dissociator
- C צינורות
- MACSmix Rotator Tube
- HBSS (w / o)
- HBSS (w)
- הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול:
- הנקס "שנאגרו מלח פתרון ללא קטיונים divalent Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS (w / o)
- HBSS, סטנדרטי, כלומר עם Ca 2 + ו - Mg 2 + (HBSS (w)
- בהתאם epitope את האנטיגן עניין ביישומים הבאים, להשתמש או Papain מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (P) או טריפסין מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (T).
- הכן את הפתרונות הבאים מן הרקמה עצבית דיסוציאציה קיט:
- פתרון 2: להוסיף בטא mercaptoethanol מ"מ 0.067
- פתרון 4: לפזר אבקת הצפת 0.7 מ"ל אחסון (מסופק בערכה), לערבב בעדינות (לא מערבולת)
- אנזימים מערבבים 1: פתרון 1.9 מ"ל פיפטה 2 ו 50 פתרון μl 1 (הן ערכה) לתוך צינור C ו דגירה של 10-15 דקות על 37 ° C. זה מספיק כדי לנתק 400 מ"ג של רקמת המוח.
2. Dissociating הרקמה העצבית
- לשקול את רקמת המוח בתוך שפופרת המכילה 1 מ"ל HBSS (w / o)
- העברת העכבר המוח לתוך הצינור C המכיל 1950 μL של מיקס אנזימים שחומם מראש 1. (הערה: בפרוטוקול זה נכתב עבור 400 מ"ג ≤, אבל כרכים פתרון וניתן לשנותם כדי להכיל עד 1600 מ"ג של רקמת המוח לכל Tube C)
- מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_01".
- דגירה עם סיבוב (4 סל"ד באמצעות Rotator Tube MACSmix) במשך 15 דקות על 37 ° C.
- מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_02".
- במהלך השלב דיסוציאציה להכין 30 μl של אנזימים מערבבים 2 מ"ג לכל 400 ברקמת ידי ערבוב בעדינות 20 μl של פתרון 3 ו - 10 μl של פתרון 4.
- הוסף מערבבים אנזימים 2 עד התחתית C באמצעות כובע, מחצה אטום ומערבבים בעדינות מבלי vortexing.
- דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור.
- מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_03".
- דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור.
- צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בחלק התחתון של הצינור.
3. סינון
- בחר מסנן מספיק גדול כדי לאפשר מעבר לתאים של עניין. למשל, תאים פורקינג' הם גדולים מדי כדי לעבור דרך מסנן 30 מיקרומטר, אך Prominin-1 + תאים תהיה.
- השתמש פיפטה μl suitable1000 כדי להסיר את התאים בצורה Tube C באמצעות כובע, מחצה אטום ולהחיל אותו מסנן ההפרדה מראש על צינור איסוף 15 מ"ל. (הערה: עבור גודל מדגם גדול יותר להשתמש צינור איסוף 50 מ"ל).
- שטפו את המסנן עם 10 מ"ל של HBSS (w).
- צנטריפוגה התאים מסוננים על XG 300 דקות 10 ב RT.
- Resuspend supernatent בינוני או חיץ של בחירה עבור יישומים הבאים.
- כדי להסיר פסולת מיאלין, המיאלין הסרת להשתמש חרוזים.
4. תוצאות נציג: אנא ראו איורים 1-3
איור. 1 דיסוציאציה המוח עם Dissociator gentleMACS הביא תאים קיימא 97%, כפי שמראה ניתוח תזרים cytometric.
איור. 2 תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות neurosphere לאחר מיון התא מגנטי באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads לאחר 7 ימים של טיפוח MACS ® NeuroMedium בתוספת MACS B27 מוסף PLUS. תאים שהוכנו מהמוח CD1 העכבר (P3), תוך שימוש ברקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P).
איור. 3 פסולת המיאלין של תא בודד המתלים פוגמת במידה ניכרת בידוד תא, סילוק פסולת המיאלין על ידי הסרת חרוזים המיאלין מגביר תא הפרדות יעילות. עבור הפרדות MACS באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads, P22 במוח העכבר היה ניתק באמצעות רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). תאים ההשעיה תא בודד היו גם להשתמש ישירות עבור ההפרדה, או הוגשו המיאלין דלדול באמצעות חרוזים המיאלין הסרת. השוואת דגימות ללא הפרדה עם הסרת המיאלין, מוכיח כי הטוהר גבוהה יותר עבור דגימות עם הסרת המיאלין הקודם.
דיון
Dissociator gentleMACS מאפשר הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מרקמות עצביים במערכת סגורה. רקמה עצבית ערכות דיסוציאציה מותאמים לשמר epitopes אנטיגן הדרושים יישומים נוספים כמו immunostainings והפרדה תא immunomagnetic 1-5. בפרוטוקול זה אנו מראים ניתוק האנזימטית עדין של המוח באמצעות העכבר Dissociator gentleMACS ואת הרקמה העצבית דיסוציאציה Kit (P), מניב בתאים קיימא 97%. 100 מ"ג של רקמה עצבית התשואות בין 6 5x10 ו 1x10 7 תאים, בהתאם לגיל של רקמות המאכסן. ממוקד Prominin-1 + תאים בודדו באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads ונלקח לאחר מכן לתוך התרבות. הפרוטוקול מוצג להיות אפילו יותר יעילה עם שימוש נוסף של חרוזים המיאלין הסרת כשעובדים עם רקמה עצבית נגזר P7> עכברים.
גילויים
הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנות C | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| gentleMACS™ ערכה למתחילים | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-235 | <קישור ל-"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ מסובב מבחנות | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| ערכה לפירוק רקמה עצבית (P) | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-092-628 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| מסנני טרום-הפרדה | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| Anti-Prominin-1 MicroBeads | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-092-333 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx |
| Anti-Prominin-1-APC | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-092-335 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx |
| חרוזי הסרת מיאלין | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-094-544 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx |
| טיפים לפיפט בהגעה מוארכת 1000 מיקרוליטר (Reach Pipet Tips) | Molecular BioProducts | מספר הזמנה 2079 | <אני מאמין שחלה טעות בשליחת הטקסט, שכן מקור הטקסט שהוזן הוא תגית HTML חלקית (`a href=`) ואינו מכיל תוכן מדעי לתרגום. אנא שלח את הטקסט המלא שברצונך לתרגם."http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61">http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<על מנת לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים במנדף זרימה למינרית. 1. חומרים ערכה לפירוק רקמה עצבית (P) (מרכיבים: תמיסות 1, 2, 3 ו-4, בופר אחסון) מסננים לפני הפרדה (אופציונלי) חרוזי הסרת מיאלין מכשיר gentleMACS Dissociator מבחנות C מסובב מבחנות MACSmix HBSS (ללא) HBSS (עם) הכין את התמיסות הבאות לפני תחילת הפרוטוקול: תמיסת מלחים חוצצת של הנקס (Hanks’ Buffered Salt Solution) ללא קטיונים דו-ערכיים Ca2+ או Mg2+ (HBSS (w/o)) HBSS סטנדרטית, כלומר עם Ca2+ ו-Mg2+ (HBSS (w)) בהתאם לאפיטופ האנטיגן הרלוונטי ליישומים הבאים, השתמש בערכה לפירוק רקמה עצבית המבוססת על פאפאין (P) או בערכה לפירוק רקמה עצבית המבוססת על טריפסין (T). הכן את התמיסות הבאות מתוך הערכה לפירוק רקמה עצבית: תמיסה 2: הוסף בטא-מרקפטואתנול עד לריכוז של 0.067 mM. תמיסה 4: המס את האבקה ב-0.7 מ"ל בופר אחסון (מסופק בערכה), ערבב בעדינות (אין להשתמש ב-vortex). תערובת אנזימים 1: העבר בפיפטה 1.9 מ"ל תמיסה 2 ו-50 מיקרוליטר תמיסה 1 (שתיהן מהערכה) למבחנת C והדגס במשך 10–15 דקות ב-37 °C. כמות זו מספיקה לפירוק של 400 מ"ג רקמת מוח. 2. פירוק הרקמה העצבית שקול רקמת מוח במבחנה המכילה 1 מ"ל HBSS (ללא). העבר מוח של עכבר למבחנת C המכילה 1,950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 1 שחוממה מראש. (הערה: פרוטוקול זה נכתב עבור ≤ 400 מ"ג, אך ניתן להתאים את נפחי התמיסות עבור עד 1,600 מ"ג של רקמת מוח למבחנת C אחת). הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_01". הדגס עם סיבוב (4 סל"ד באמצעות מסובב מבחנות MACSmix) למשך 15 דקות ב-37 °C. הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_02". במהלך שלב הפירוק, הכן 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 2 לכל 400 מ"ג רקמה על ידי ערבוב עדין של 20 מיקרוליטר תמיסה 3 ו-10 מיקרוליטר תמיסה 4. הוסף את תערובת אנזימים 2 למבחנת C דרך הפקק האטום בספטום וערבב בעדינות ללא vortex. הדגס את מבחנת C עם סיבוב למשך 10 דקות ב-37 °C באינקובטור. הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_03". הדגס את מבחנת C עם סיבוב למשך 10 דקות ב-37 °C באינקובטור. בצע צנטריפוגה קצרה כדי לרכז את הדגימה בתחתית המבחנה. 3. סינון בחר מסנן גדול מספיק כדי לאפשר מעבר של התאים הרלוונטיים. לדוגמה, תאי פורקיניה גדולים מדי מכדי לעבור במסנן של 30 מיקרומטר, אך תאי +Prominin-1 יעברו. השתמש בפיפטה מתאימה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוציא את התאים ממבחנת C דרך הפקק האטום בספטום והעבר אותם למסנן לפני הפרדה המונח על מבחנת איסוף של 15 מ"ל. (הערה: עבור גדלי דגימות גדולים יותר, השתמש במבחנת איסוף של 50 מ"ל). שטוף את המסנן עם 10 מ"ל HBSS (עם). בצע צנטריפוגה לתאים המסוננים ב-300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השביט מחדש את supernatant במדיום או בבופר לבחירתך עבור היישומים הבאים. להסרת שאריות מיאלין, השתמש בחרוזי הסרת מיאלין (Myelin Removal Beads). 4. תוצאה מייצגת: ראה איורים 1-3 איור 1: פירוק המוח באמצעות ה-gentleMACS Dissociator הניב 97% תאים חיים, כפי שמוצג בניתוח ציטומטריה עם זרימה. איור 2: תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות נוירוספירות לאחר מיון תאים מגנטי באמצעות Anti-Prominin-1 MicroBeads, לאחר 7 ימי תרבית ב-MACS® NeuroMedium בתוספת MACS Supplement B27 PLUS. התאים הוכנו ממוח של עכבר CD1 (P3) באמצעות הערכה לפירוק רקמה עצבית (P). איור 3: שאריות מיאלין בסספנסיות של תאים בודדים פוגעות באופן ניכר בבידוד התאים, והסרת שאריות מיאלין באמצעות Myelin Removal Beads מעלה את יעילות הפרדת התאים. עבור הפרדות MACS באמצעות Anti-Prominin-1 MicroBeads, מוח של עכבר P22 פורק באמצעות הערכה לפירוק רקמה עצבית (P). תאים מהסספנסיות של התאים הבודדים שימשו ישירות להפרדה, או שהועברו לתהליך של דה-מיאלינציה באמצעות Myelin Removal Beads. השוואה בין ההפרדה מדגימות ללא הסרת מיאלין לדגימות עם הסרת מיאלין מדגימה כי רמת הטוהר גבוהה יותר בדגימות שעברו הסרת מיאלין מוקדמת.><קישור ל-"http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html">http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
| ערכה לפירוק רקמה עצבית (T) | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-231 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| תמיסת פרופידיום יודאיד | Miltenyi Biotec | מספר הזמנה 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
מקורות
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
הדפסות חוזרות והרשאות
