שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

סיכום

בסרט זה אנו מבצעים הקלטה electroretinogram, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal עם הסרטן האמריקנית פרסה, Limulus פוליפמוס. פרדיגמות אלו אלקטרו יכול לשמש חוקר את הבסיס העצבי של חזון במחקר מעבדה או הוראה.

תקציר

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס הוא אחד היצורים העתיקים ביותר על פני האדמה, החיה ממשיכה לשחק תפקיד חיוני במחקר ביו. לא רק דמם מכיל תאים מיוחדים המדענים להשתמש כדי לזהות bacteriotoxins בתרופות שלנו, אבל העיניים שלהם מכילים גם רשת עצבית כי סיפקה תובנה הרבה על תהליכים פיזיולוגיים הפועלים מערכת הראייה שלנו, כגון הסתגלות קלה עיכוב לרוחב. סרטן פרסה נשאר מודל אטרקטיבי מחקר חזון כי בעל החיים הוא גדול hardy עבור חסרי חוליות, הנוירונים ברשתית שלה גדולים ונגישים, מערכת הראייה שלה הוא קומפקטי למד בהרחבה, התנהגות החזותי שלה מוגדר היטב. יתר על כן, המבנה והתפקוד של העיניים מווסתת על בסיס יומי על ידי השעון הביולוגי במוח של בעלי חיים. בקיצור, מערכת הראייה של סרטני פרסה היא פשוטה מספיק כדי להבין זאת מורכבת מספיק כדי להיות מעניין.

בסרט זה אנו מציגים three פרדיגמות אלקטרו עבור חוקרת את הבסיס העצבי של חזון זה ניתן לבצע in vivo עם Limulus. הם electroretinogram הקלטה, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal. Electroretinogram (ERG) הקלטות למדוד עם משטח אלקטרודה חשמלית סיכם את התגובה של כל התאים בעין אל בהבזק אור. הם יכולים לשמש כדי לפקח על הרגישות הכוללת של העין עבור להאריך את פרקי הזמן. הקלטות עצב הראייה למדוד את פעילות spiking של סיבי עצב בודד באמצעות אלקטרודה מיקרו תאית. הם יכולים לשמש ללמוד העביר מסרים חזותיים מן העין אל המוח, כמו גם היממה לשעון הודעות מוזן חזרה מהמוח אל העין. למדוד הקלטות Intraretinal עם microelectrode תאיים תנודות המתח המושרה על ידי אור תאים בודדים של העין. הם יכולים לשמש להבהיר מנגנוני הסלולר של עיבוד ברשתית.

פרוטוקול

חלק 1: הכנת ניסויית

הפרוצדורות שבוצעו על סרטני הפרסה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת בוסטון. בעלי חיים שנקנו מעבדות לביולוגיה ימית (וודס הול, מסצ'וסטס) או ספק אחר ושוכנו טנק מים מלוחים סודה בחדר חשוף מחזור אור כהה מוסדר. משטר תאורה חשוב entraining שעון היממה של סרטן ורכיבה על אופניים העין יומי בין מדינות יום ולילה שלה. מיד לפני תחילת כל הליכים פולשניים, החיה הוא מקורר בדלי קרח במשך 10-15 דקות, עד תנועה שלה היא האטה מאובטח אז אל במת עץ עם שני ברגים נירוסטה הוכנס prosoma ושניים opisthosoma. הפלטפורמה היא משוקלל מתחת עם גרניט, כך שוקע במים. לאחר ניסויים בבעלי חיים הוא מסוף מורדמים ידי טבילה לתוך slurry קרח שוב pithing המוח, הנמצאת מעל הפה, באמצעות אזמל מנתחים.

חלק 2: פתרונות

פתרון Limulus רינגר מורכב 430 mM NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, HEPES 50μM, ו 10 מ"ל / L עט סטרפטוקוקוס לערבב (פניצילין, סטרפטומיצין, 10,000 יחידות / מ"ל) .

חלק 3: הקלטה Electroretinogram

כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, וזלין, הפתרון של רינגר, פיפטה העברה, הנורית הירוקה, חדר הקלטה, ברגים נירוסטה, ו ספוגית כותנה.

1. תא בעבודת יד משמש כדי להקליט את ERG (איור 1A). גוף תא נועד להחזיק מאגר מלוחים במגע עם העין. המכסה מכיל חוט כסף כלורי עבור צימוד הפתרון מוליך למגבר ואת חור קטן בגודל כדי להתאים LED. Ultrabright LED עם פליטת שיא סביב 520nm עובד הכי טוב.
2. כדי להתחיל, החלק התחתון של החדר מצופה וזלין ומאובטחת על העין עם שני ברגים.
3. החדר מתמלא אז עם מליחים כתרים עם המכסה.
4. לאחר ההתקשרות לתא סרטן ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים.
5. כבל ה-LED מוכנס לתוך המכסה קאמרית.
6. להוביל אות הוא מוצמד חוט כלוריד, ואת להוביל התייחסות נחתך לאחד הברגים המושתלים.
7. מוביל הן מחוברות לבמה ראש מגבר גבוהה עכבה ההפרש (X-cell 3x4, fhc Inc) עבור הגברה האות המסנן מגבר מוגדר להעביר תדרים 10Hz להלן.
8. הפלט מגבר מוזן על אוסצילוסקופ לצפייה ללוח נתונים הרכישה לניתוח המחשב ואחסון.
9. לאחר ההתקנה דלת הכלוב סגורה כדי לחסום אור בחדר מלהגיע בעלי חיים.
10. הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית גלי ה-LED, הרשומות עורר ERG האות, מודדת את המשרעת שיא אל שיא התגובה. הבחירה הפרדיגמה פלאש תלוי אובייקטיבי הניסוי. כך, למשל, להחיל קצרה (100ms) הדופק של 5V כל 10 דקות אל LED ימנע תופעות של הסתגלות אור כאשר ניטור שינויים היממה ברגישות העין.

חלק 4: הקלטה עצב הראייה

כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, חוט, מקדחה, הפתרון של רינגר, rongeurs, מספריים vannas, חדר הקלטה, מלקחיים מעוקל, בדיקות מחט בסדר, עמום אזמל, מספריים כירורגיות, ו אלקטרודה יניקה.

1. תא בעבודת יד משמש שיא התגובות עצב הראייה (איור 1B). פנים החדר הוא 2cm בקוטר היטב כי יש לפתוח פתח דק מחוררת חצי עגול בקיר התחתון כדי להכיל את העצב ולבודד אותו לרקמות.
2. לפני ההתקשרות קאמרית מחט 16-מד מוכנס בין השרירים הציר לתוך הלב ~ 20cc של דם מנוקז מן החיה. Exsanguination לא הכרחי אבל עושה דיסקציה עצב הראייה קל.
3. המיקום של עצב הראייה נאמדת על ידי ציור על שריון קו מעוקל מעט בין העיניים לרוחב חציון.
4. חור עגול הוא חתך אז שריון עם מקדחה. החור הוא בקוטר זהה החדר היטב. המרכז של החור ממוקם 2-3 ס"מ הקדמי לעין לרוחב הגב מעט לקו, כך עצב העובר לאורך החלק הגחוני של הבאר.
5. רקמת חיבור מנוקה עד עצב גלוי לגמרי וללא שמסביב הבסיסית רקמות.
6. גדיל של חוט הוא כרך סביב העצב ומשך החדרה דרך חריץ בתחתית. דרך פתח זה אותו עצב מונחה בעדינות על ידי משיכת החוט אל תוך החדר. במקביל החדר היטב מוכנס לתוך החור. החדר היא מודבקת אז שריוןעם ברגים היטב מתמלא הפתרון של רינגר.
7. לאחר ההתקשרות לתא החי ממוקמת בתוך כלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים.
8. גם היא דמיינו תחת stereoscope (SMZ-168, ג'ד פלה Inc) וכותנה הוא מרופד סביב פתח בתחתית כדי למנוע דליפה של דם לתוך מלוחים מתוך החדר.
9. רקמת חיבור שיורית סביב העצב יוסר עם מספריים פינצטה בסדר, הוא מילא את החדר עם פתרון Ringer של טרי.
10. הכינוי מורכב מכלי הדם כי מתמצת את העצבים דרך הפתח הזה העצב הוא desheathed בקפידה לאורכו בעזרת מספריים בסדר, פינצטה, ועל בדיקות מחט.
11. צרור סיבים זעירים מופרד מן העצב באמצעות בדיקה לחתוך בקצה הרחוק מן העין הקלטה סיב מביא ובסוף הקרוב לעין הקלטה סיבים efferent. בסרטון בסוף להקלטות סיב מביא נחתך.
12. אלקטרודה מיקרו (AM Systems Inc) מלא פתרון האצבעות משמש להקלטת עצב הראייה. קצה האלקטרודה הוא מצויד צרור העצבים מאש ליטוש סוף זכוכית בקוטר 1mm בורוסיליקט נימי.
13. קצה האלקטרודה יורדת לתוך תא היטב עם מניפולטור ידני (WPI Inc), ואת חבילת סיבי לחתוך הוא נשאב לתוך קצה. יניקה מסופק על ידי מזרק Gilmont מחובר האלקטרודה דרך צינורות.
14. חיבור BNC מספק את האות להוביל כלוריד כסף תיל סביב אלקטרודה כדי להפחית את הרעש מספק להוביל התייחסות. שני מוביל מחוברים שלב ראש מגבר ההפרש עבור הגברה אות ורעש סינון (X-cell 3x4, fhc Inc). הפלט מגבר נשלח אוסצילוסקופ לצפייה כרטיס רכישת נתונים לניתוח המחשב ואחסון.
15. הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג' למחקר Systems Inc) וממשקים עם ספייק דיגיטלי מאבחן (APM, fhc Inc) כי רשומות רכבות ספייק. אור יכול להיות מועברת על תאים בודדים בעין באמצעות צינור אור בסיבים אופטיים או לעין כל דרך להציג מבוקרת מחשב וידאו.

חלק 5: הקלטה Intraretinal

כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, בצורת פלטפורמה פייברגלס עם חורי הברגים הליכי, בעל microelectrode עם פיפטה זכוכית, ברגים נירוסטה, פינצטה, ו אזמל בסדר.

1. צלחת עבודת יד פייברגלס עם חורי הברגים מראש משמש שיא התגובות תאיים. החורים הם במרווחים עבור הרכבה micromanipulator ממונע (PPM5000, Inc WPI). הצלחת מחוברת החיה עם שני ברגים בצד אחד על גבי.
2. לאחר הצלחת קובץ מצורף החיה ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים.
3. Micropositioner הוא מוברג לתוך הצלחת, עם זרוע מטלטלין שלה מיושר מעל העין.
4. אצווה של micropipettes זכוכית נמשכים מ -1 מ"מ OD בורוסיליקט זכוכית את הטיפים הם backfilled דרך פעולה נימי ידי הנחת micropipettes בבקבוקון קטן של פתרון KCl 3M.
5. שאר pipettes מתמלאים באופן ידני את הפתרון מלח ונוסף בעל אלקטרודה.
6. בעל אלקטרודה מחוברת בשלב ראש מגבר תאיים (IR-283, Cygnus טכנולוגיה Inc) מודבקת הזרוע micropositioner.
7. קטע קטן של הרשתית (~ 1mm2) נחשף על ידי חיתוך משם את ממשק הקרנית עם סכין גילוח.
8. ירידה של הפתרון של רינגר מושם על הרשתית חשוף כדי למנוע ייבוש קצה micropipette מתקדמת דרך הפתח לתוך רקמת הרשתית.
9. כאשר קצה נכנס הפתרון, במצב הנוכחי הזרקה של המגבר תאיים עוסקת ואת עכבה אלקטרודה נמדד. Micropipettes עם עכבה מחוץ לטווח של 20-70 מגוואט מבוטלים. אלה בטווח זה הם מתקדמים בצעדים מיקרון משופדת לתוך התאים על ידי רוטט קצה פיפטה אלקטרונית או מכנית.
10. שלושה סוגים של תאים עשויים להיות נתקל בעיניים. תאים Retinular להציג רק תגובה depolarizing לאור, תאים אקסצנטרי להראות רכבת של פוטנציאל פעולה רכיבה על תגובה depolarizing, ותאי הפיגמנט להראות אין תגובה אור בכלל.
11. הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג' מערכות מחקר). הגירויים מועברים לתאי משופדת עם צינור סיב אופטי או להציג וידאו. התגובות מתח הם נצפו על אוסצילוסקופ ואת דיגיטציה על ידי התוכנית למחשב.

חלק 6: תוצאות נציג

ERG נציג מוצג בתרשים 2A. הגל מייצג את החשמל סיכםבתגובה לאור בעיקר בתאי retinular photoreceptive, כפי שהם עולים במספרם בהרבה על התאים אקסצנטרית הם מצמידים חשמלית להם. אין רכיבים waveform מרובים סוגי תאים שונים ברשתית כמו עם ERG יונקים. משוב מן היממה שעון במוח Limulus מודולציה את המאפיינים הפיזיולוגיים של תאים ברשתית על בסיס יומי, גורם כמובן משרעת וזמן של ERG להשתנות לאורך זמן (1). כפי שניתן לראות בתרשים 2B, ERG המשרעת היא הגבוהה ביותר במהלך הלילה הסובייקטיבית של בעלי החיים הנמוכה ביותר במהלך היום סובייקטיבי.

עקבות נציג תגובה עצב יחיד סיבים אופטיים לאור מוצג באיור 3. תאים אקסצנטרי כל להתנהג בערך אותו הדבר, מראה עלייה חולף בשיעור הפרשות ספייק ואחריו דעיכה לרמה מתמשכת. קצב הדעיכה משקפת את הפעולה המשולבת של הסתגלות אור ספייק תלויי עצמית עיכוב על תאים אקסצנטרי (2). אחר דפוסי ספייק, כגון אור תלויי יורדת בשיעור, נתפסים במוח Limulus אך לא את העין (3).

עקבות נציג התגובה מתח של תא תא פיגמנט, תא retinular ו אקסצנטרי לאור מוצגים באיור 4. רק שני האחרונים סוגי תאים ברשתית הם חזותיים. הקורס משרעת וזמן התגובה שלהם תלוי באיכות ההקלטה ואת מיקום האלקטרודה בתוך התא. בדרך כלל, האלקטרודה חודר לתאי פיגמנט או תאים retinular בגלל גודל גדול שלהם מספר. אם זה האחרון, שלילת קוטביות חולף כי דועך לרמה מתמשכת מוקלט. עששת היא בשל הסתגלות לאור על ידי תאים retinular (2). אם האלקטרודה נכנס לתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה גדול נרשמים האקסון (40-70mV) פוטנציאל פעולה קטן רוכב על הגל depolarizing (<25mV) ליד סומה.

באיור 1. דיאגרמות סכמטי של תאים המשמשים הקלטה electroretinogram (א) ו הקלטה עצב הראייה (B). בר שווה 7mm ב A ו B. ב 5mm

איור 2. עקבות דוגמה ERG Limulus שעורר 100ms LED הדופק של 5V בחושך (א) ואת תנודות שיא אל שיא ERG אמפליטודה לאורך זמן בחשכה מתמדת (B). החושך היה יזם בזמן המצוין על ידי המשולש הלבן. הגידול ERG משרעת בזמן המצוין על ידי המשולש השחור בשל הסתגלות אור, אשר מגדילה את רגישות העין בחושך. וריאציה מחזוריים ERG משרעת לאחר מכן בשל השעון הביולוגי הפנימי של בעלי חיים. נקודות זמן ב 'הם כל 5min.

איור 3. עקבות דוגמה תגובה עצב סיב אופטי אל האור הבזיק על הקולטן ommatidial יחיד. Waveform מעל זכר מראה עיתוי הגירוי. תאים אקסצנטרי, אשר אקסונים להצמיח סיבי עצב, כל להראות דפוס דומה של ירי כמו זה בתנאי תאורה של הניסוי (5sec פלאש בחשיכה מוחלטת). קידוד רשתית עם קוצים הוא Limulus יש רכוש משותף עם יונקים, בניגוד חסרי חוליות אחרים.

איור 4 עקבות דוגמה התגובה מתח לאור של שלושה סוגי תאים הנמצאים בעין לרוחב Limulus:. תא פיגמנט (A), תא retinular (ב), ותא אקסצנטרי (C). התא הראשון הוא אי - ראייה. שני האחרונים depolarize על הבזק אור. שלילת קוטביות היא הגדולה ביותר עבור תאים retinular כי הם transduce את האור לשלוח את האות דרך צמתים הפער לתא אקסצנטרי, עם הפסד כלשהו לאורך הדרך. בתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה שנורו על ידי האקסון נראים רכיבה על שלילת קוטביות עקב backpropagation ספייק לתוך סומה. משרעת של פוטנציאל פעולה כבר נחלש באיור עבור צפייה טובה יותר של הפוטנציאל depolarizing. פוטנציאל המנוחה של התאים הוא-50mV.

דיון

יש לנו להדגים כיצד לבצע הקלטות ERG, הקלטות עצב הראייה, והקלטות intraretinal על סרטני הפרסה in vivo. טכניקות הקלטה כל לספק תובנות שונות לתוך הבסיס העצבי של חזון, והם יכולים לשמש כדי לחקור פונקציה הרשתית הודות בבעלי חיים כדי עיניים גדולות של סרטן ו שריון קשה. פעילות עצב הראייה יכול אפילו להיות מוקלט מ מתנהגת בחופשיות בעלי חיים בים עם בנייה נכונה של אלקטרודות (4). טכניקות אלה יכולים גם להתבצע על העיניים נכרת עם שינויים קלים של ההתקנה. הרלוונטיות של ניסויים כאלה למצבו הטבעי יהיה מוגבל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דיודה פולטת אור (LED)	מקור אור	Newark Inc	33C1292
אלקטרודת יניקה	אלקטרודה	A-M Systems	573000
מגבר חוץ-תאי בעל 3*4 ערוצים מדגם XCell	מגבר	FHC, Inc.	40-40-8B
הקלטה תוך-תאית	מגבר	Cygnus	IR-283A
APM	מבדיל ספייקים עצביים	FHC, Inc.	APM
Bits++	לוח סרטונים	Cambridge Research Systems	Bits++
מניפולטור Piezopatch	מיקרו-ממצב (Micropositioner)	World Precision Instruments, Inc.	PPM5000
ממריץ פולסים מרובעים	ממריץ עצבים	טכנולוגיות דגלים	דגם S48
P-97	מכשיר למשיכת מיקרופיפטות	Sutter Instrument Co.	דגם P-97
קפילרית זכוכית בורוסיליקטית	זכוכית אלקטרודה	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
סוסים– סרטן (<מיקרוסקופיה אלקטרונית* *(הערה: המונח "em" הוא קיצור מקובל ל-Electron Microscopy)*>*Limulus polyphemus*)	בעל חיים	מעבדות ביולוגיה ימיות
מכשיר למשיכת מיקרופיפטות	מכשיר למשיכת זכוכית	Sutter Instrument Co.	P-97
מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם זום	מיקרוסקופ	Jed Pella Inc.	SMZ-168