$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
לפני שתתחיל
למבוגרים לבבות
- טרי להכין hemolymph מלאכותי (א.ה.) תמיסה המכילה 108mM Na +, 5mm K +, 2mm Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1mm לאא 2 PO 4, 4 מ"מ NaHCO 3, סוכרוז 10mm, trehalose 5mm, HEPES 5mm (pH 7.1, כל ריאגנטים מ סיגמא כימיקלים). סוכרוז ו trehalose יש להוסיף AH מפתרונות מניות בקירור רק לפני השימוש כדי למנוע זיהום חיידקי.
- מביאים לטמפרטורת החדר AH פתרון חמצן על ידי מבעבע האוויר דקות לפחות 15.
- משוך נימים מצוין מספר (למשל זכוכית נימים, 100ul, VWR) נדרש להסרת שומן.
הזחל לבבות
- Sylgard מצופה coverslips: באמצעות העברה, קיסם על 50-70μl של פתרון Sylgard על coverslip 22x22mm. תן להקשיח Sylgard ב 65 ° C במשך הלילה.
- הכן את Broadie ו חיץ של בייט (135mm NaCl, KCl 5 מ"מ, 4 מ"מ MgCl 2, 2mm CaCl 2, TES 5mm, סוכרוז 36mM;. PH 7.15 ראה Broadie ו בייט, 1993).
- הכינו את הכלים הדרושים כדי ליישם את הדבק histoacryl. ראשית, למשוך כמה נימים קנס (למשל מוצרים המדע GB100T8P). חבר קצה פיפטה 1.5ml עם צינורות פלסטיק קטנה (Tygon, 1 / 32 ") על ידי הוספת את הקצה הקטן יותר לתוך הצינור. הכנס נימי עם פתח רחב שלה לקצה השני. טען את נימי עם דבק Histoacryl על ידי טבילה נימי לתוך טיפת דבק שאיבה עדינה לתוך קצה הפלסטיק. כאשר עובדים עם דבק אחד צריך כוס שנייה נימי בהישג יד כדי להסיר דבק יתר מקצה הדבק נימי. הוא דבק נוזלי עד שהוא בא במגע עם מי מלח שנאגרו בו יהיה להקשיח בתוך כמה שניות. עם זאת, בדרך כלל נשאר פלסטיק מספיק זמן כדי להסיר את הדבק קצה נימי או תוך יישום זה הדגימה.
חצי שלם תסיסנית הלב מן טוס למבוגרים
- למבוגרים זבובי תסיסנית מורדמים עם שנאפ Fly (קרוליינה ביולוגית אספקת ושות) במשך 2-5 דקות. יש להקפיד לא לצאת זבובים שנאפ Fly עבור חשיפות ארוכות יותר. חשיפה לטווח קצר לקור יכול לשמש גם כדי להרדים זבובים אבל CO 2 אינה מומלצת שכן יש כבר השפעה מתמשכת על קצב הלב ואת המקצב.
- זבובים הרדים ממוקמות, צד הגב למטה, לתוך צלחת פטרי מצופה בשכבה דקה של וזלין. לציפורן הידרופובי את הכנפיים והגוף הפיך "לתקוע" את ג'לי אבל לעוף ניתן למקמו מחדש במידת הצורך. זה הופך להיות חשוב במיוחד במהלך מניפולציות הבאים.
- לחתוך הראשונית נעשית באמצעות זוג מספריים המעוגל של האביב (Roboz # 5611). להבי מספריים מושמים תחת הרגליים בזווית לעבר השטח הגבי של החזה ליד הצוואר. ראש, כבל עצב הגחון, והרגליים יוסרו עם חתך אחד. הכנה הוא שקוע אז hemolymph, מחומצן פתרון מלאכותי (AH).
- בעזרת מספריים האביב בקצה האחורי של הבטן (המורכב מקטעי בטן 7 ו - 8) מוסר עם חתך אחד. זה מספק גישה לביצוע קיצוץ רוחבי לאורך שני הקצוות של הבטן משמש כדי לנתק את הקשר בין המעי האחורי ואת לציפורן הבטן. דש משוחררים של לציפורן בטן הגחון מוסר מכן.
- בשלבים 3 ו 4 חיבורי הקדמי ואת האחורי של הבטן, נותקו כל כך את אברי הבטן מוחזקים כעת רק על ידי tracheols במקום. הבטן ואת אברי הבטן האחרים בדרך כלל ניתן להסיר כגוש אחד באמצעות מלקחיים של צורף (Roboz, # 55) ועדין מושכת. הסרת איברים פנימיים חושף את הצינור הלב הפועם עדיין מחוברת לציפורן הגב מוקף גופים שומן.
- הגופים שומן הן אטומות למדי מיקרוסקופ האור וכתוצאה מכך הוא לעתים קרובות יש צורך להסיר חלק זה של שומן על מנת לראות את צינור לב בבירור. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בטכניקה של שאיבת שומן נמשך דק זכוכית הנימים. נימים מתבצעות בעזרת פיפטה תקן חולץ (למשל סאטר P-97 פיפטה פולר) ו מוכנסים מכן לתוך צינורות פלסטיק (Tygon, 1 / 16 "), מחוברת למקור ואקום. מערכת זו משמשת כדי יניקה את עודפי השומן מן סביב הצינור לב. כוח יניקה הוא יחסי בקוטר טיפ כך pipettes עם טיפים גדול יותר בקוטר 40 מיקרון לא אמור לשמש. זהירות קיצוניים צריך לנקוט כדי להימנע מלגעת בלב עצמו, כי את החלק האחורי של הלב היא שברירית מאוד באזור יש להימנע לחלוטין.
- צינור הלב המבוגר תסיסנית נחשפת עכשיו צריך להכות. אם יש צורך בלב לציפורן בצירוף ניתן למקמו מחדש על ידי הסרת לציפורן בעדינות מתוך ג'לי נפט בזהירות בטישה אותו בחזרה למטה, שוב להימנע מכל מגע עם הרקמה בלב. ב tהנקודה שלו הפתרון רחצה והכנת יש להחליף אהל טריים. הכנה זו יש לאפשר לאזן עבור 20-30 דקות עם חמצון לפני כל המניפולציות. אם ההכנה היא להישמר במשך יותר מ -60 דקות הוא צריך להיות עם perfused אהל טריים.
משתק תסיסנית הזחלים הקלטה אופטית
- מניחים טיפת דבק Histoacryl קרוב לפינה כל אחד coverslips Sylgard. הוסף 50μl של חיץ B & B של טיפות דבק אשר להקשיח מייד. למלא את החלל בין נקודות מודבק עם B & B - דבק ימשיך החיץ בשקופית.
- קחו הזחל נודד L3 ולמקם אותו על פיסת נייר רטובה על קרח דק '2. זה יהיה להאט את תנועתה. ואז להעביר את זחל לתוך המאגר ואת לכוון אותו עם הצד הגבי מעלה (זה הצד של הזחל כי חסרה את חגורות denticle). להחיל במהירות קצת דבק בין אזור הראש ואת Sylgard. דבק להקשיח יהיה מהר מאוד למנוע את ראשו של הזחל לנוע.
- בעזרת מלקחיים ובזהירות לתפוס את החיה על ידי spiracles האחורי ובעדינות למתוח אותו. לתקן את הזחל בתפקיד זה על ידי יישום דבק לאורך שני הצדדים של הזחל במחצית האחורי. כדי לצמצם תנועה נוספת של לציפורן על ידי השרירים בגוף הקיר, להוסיף דבק יותר את צלעותיה של הבהמה. הזחל הוא קבוע עכשיו במצב הזה. Coverslip ניתן להציב לתוך צלחת פטרי קטן מלא אהל או PBS. פעימות הלב יכול עכשיו להיות מוקלט ללא הפרעה מן הקיר תנועות הגוף.
נציג תוצאות:
בלב חצי שלם תסיסנית הבוגרת תנצח בקצב שעות לאחר הניתוח, כאשר נשמר, AH טרי מחומצן (ראה נתונים משלימה, Ocorr, et al. 2007). למשל נציג מוצג סרט 1. לבבות של הזחל 3 rd instar וזבובים צעירים (1 - 3 שבועות eclosion פוסט) בדרך כלל התערוכה פעימות לב קבוע בשיעורים שבין 1 ל - 3 הרץ. זבובים מעל גיל 3 שבועות, בדרך כלל הם arrhythmic יותר, ובכל זאת הלב אלה עדיין מסוגל לנצח באופן ספונטני במשך שעות אהל מחומצן. לבבות של זבובים בוגרים, כי הם ניזוק כתוצאה של ההליך לנתיחה בדרך כלל מראים אזורים נקודתיים של מועקה קיצוניים לא מצליחים להירגע. שיעורי Heartbeat איטי יותר מאשר הרץ 1 הם נצפו לעתים נדירות זבובים צעירים יותר בגיל 3 שבועות, וכתוצאה מכך הכנות כאלה נחשבים פגום מבוטלים.
לחץ כאן כדי להוריד סרט 1. - אחד מבוגר בן שבוע wildtype לטוס (זן w מעבדה 1118) מראה את צינור חשוף בלב הבטן (קדמי משמאל). הערה רגילה, התכווצויות קצובות. אזורים אטום בפינה הימנית העליונה הם הגופים הנותרים שומן בבטן, תאים עגולים בכל צד של הלב הם התאים קרום הלב.