הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1474

⸱

12 באוקטובר 2009

 , 
1Institute for Systems Biology

במאמר זה

סיכום

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.

פרוטוקול

תא צמיחה התקשורת

  1. מושבה אחת של תאים BY4742Δarg4Δlys1 לילה 100 מ"ל מדיה עשירה כדי OD 600 של זרע אז 1.0 לשתי התרבויות 1 ליטר של מדיום שמרים מינימלי (0.17% חנקן שמרים ללא בסיס אמוניום סולפט או חומצות אמינו, אמוניום סולפט 0.5%) המכיל מלא של חומצות אמינו, בתוספת L / 20 מ"ג של ארגנין נורמלי isotopically או כבד (13 ג 6 15 N 4; Isotec) ו ליזין (13 ג 6 15 N 2; Isotec).
  2. התאים גדלו במשך 18 שעות, כדי OD 600 של 1.8. זה קריטי, כי התאים לעבור לפחות 9 דורות כדי להשיג שילוב מלא של איזוטופים שכותרתו. המדגם היה אור pelleted, שטפתי עם מים סטריליים, reseeded לתוך oleate המכיל בינוני (רגיל isotopically ארגינין וליזין, Oleate 0.2% (כימיקלים סיגמא) ו 0.5% Tween 40 (Sigma כימיקלים)) ועורר עוד 85 דקות. זה מניב אור isotopically, ביחס ארגינין ליזין, oleate-מגורה מדגם כבד isotopically גלוקוז מבוגר מדגם התייחסות.

תמוגה התא, בידוד ההיפוך חלוקה של פפטידים

  1. לשקול בקבוק צנטריפוגות. קציר דגימות על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות. הסר מדיה לשאוב נוזל עודף. לשקול גלולה ובקבוק (יהיו בדרך כלל התשואות בין 1-2 גרם) ואז להקפיא פלאש חנקן נוזלי. הוסף נפח שווה למשקל של גלולה חיץ "טחינה" של כדורי מוקפאת בחנקן נוזלי (בופר פוספט (PBS, Gibco), 10% גליצרול, מעכבי פרוטאז (מעכבי פרוטאז SigmaFAST טבליות, Sigma) ולעצור מעכבי phosphatase (Thermo Scientific )).
  2. להקפיא את כלי שחיקה של חנקן נוזלי. המתן עד חנקן נוזלי חדל רותחים. מעבירים את גלולה לכלי השיט שחיקה, עם מיסבים קפוא.
  3. טוחנים בסל"ד 600 עם מחזור 1 דקות 20 שניות עם היפוך כיוון במשך 3 דקות. Refreeze כלי שחיקה של חנקן נוזלי. חזור 4 פעמים יותר במשך 15 דקות זמן שחיקה מוחלטת.
  4. אסוף את grindate קפוא לתוך שפופרת 50 מ"ל קרח פלקון מקום יבש. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש.
  5. בצע פתרון 10ml של 8M אוריאה, אמוניום ביקרבונט 0.1M, 0.1M טריס pH 8.6. הוסף 3 כרכים של למאגר אוריאה עד נפח של 1 grindate הקפוא (עבור 3mls דוגמה למאגר אוריאה להוסיף 1 גרם גלולה עם 1 מ"ל של PBS חיץ). מיד sonicate את התערובת עם sonicator בדיקה קצה (2-10 פעימות השני). שמרו על קצה בתחתית הצינור כדי למנוע הקצפה של הפתרון. Grindate צריך מיד להיכנס פתרון.
  6. נקה את lysate ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. העברת supernatant לצינורות טריים.
  8. הפוך aliquot טרי טריס 0.5m [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP). הוסף מדגם בשעה 1:100 ריכוז סופי 5mm. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 ח
  9. אלקילציה של cysteines מופחת. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. הפוך aliquot טרי iodoacetamide 1M. שמור בחושך (אנחנו לעטוף את צינור בנייר כסף). הוסף בריכוז הסופי של 20mm. דגירה בחושך 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. להרוות את iodoacetamide עם DTT 20mm ממלאי 1M בטמפרטורת החדר 1 ח
  11. לכמת את החלבונים עם ברדפורד סטנדרטי או BCA assay (לא תיאר). קח דוגמה לניתוח על ידי SDS להלן.
  12. כדי לאמת שילוב של איזוטופים כבדים, שימוש 100 μl של lysate מופחת alkylated. לדלל 1:04 עם DH 2 O, sonicate ולהוסיף טריפסין על חלבון 50:1 כדי טריפסין. תקציר עבור מינימום של 4 שעות, מדגם יבש למטה במהירות VAC ו desalt אז עם עמודות Ultramicrospin C18 (קבוצת קן).
    1. טור מימה עם μl 100 של אצטוניטריל
    2. לאזן עם TFA 200 μl 0.1%.
    3. Resuspend מדגם יבש TFA 200 μl 0.1%. עומס על עמוד. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה.
    4. שטפו פעמיים עם TFA 200 μl 0.1%.
    5. Elute עם פעמיים עם אצטוניטריל 50 60% μl, TFA 0.1%.
    6. מדגם יבש במהירות VAC.
    7. מדגם Resuspend בחומצה פורמית μl 20 0.1%. הפעלה 2 μl על ספקטרומטר מסה. בדוק שילוב של כבד isotopically ארגינין וליזין על ידי שינוי דלתון 10 ו -8 הספקטרום m / z בהתאמה. שילוב של חומצה אמינית כל צריך להיות בין 96-98%.
  13. לערבב כמויות שוות ערך (מ"ג של חלבונים) של דגימות כבד isotopically ואור.
  14. מדולל מדגם 01:04 מתנול עם 20%.
  15. הוספת טריפסין ב 1:200. דגירה לילה בשעה 37 ° C.
  16. בדוק העיכול כי הלכה השלמת ידי SDS. הפעלה 2 ו - 4 μl של המדגם predigestion ו 8ד 16 μl של טריפסין הודעה לעכל. דמיינו ידי מכתים Coomassie כי עיכול תושלם. אם זה לא שלם, sonicate המדגם עם בקצרה קצה החללית sonicator ולעכל שוב עם טריפסין.
  17. יבש המדגם למטה במהירות VAC. כאשר מוסיפים יבש 200 μl של מסונן DH 2 O ו מערבולת עד גלולה נכנס הפתרון. מדגם יבש למטה במהירות VAC. Resuspend שוב עם DH 2 O. יבש מדגם שוב.
  18. Resuspend גלולה בחומצה Trifluoracetic 0.1% (TFA; סיגמא). בדוק כי ה-pH הוא בסביבות 3 באמצעות רצועות pH. אם יש צורך להפוך לחומצה TFA עם 10%.
  19. גלולה את כל המשקע.
  20. Desalt דגימות על עמודה ספטמבר-Pak ווטרס Vac מ"ג 500 C18. אל תעמיס יותר מדי עמודות אלה. הסכום המקסימלי הוא 5 מ"ג אבל עדיף להעמיס קצת פחות. מחלקים את המדגם בין עמודות מרובות במידת הצורך.
    1. טור מימה עם אצטוניטריל 5 מ"ל ב -100%. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה.
    2. לאזן טור עם TFA 0.1% 5 מ"ל. טען המדגם. איסוף זרימה לטעון שוב.
    3. לשטוף עם TFA 5 מ"ל 0.1%. חזור.
    4. Elute עם אצטוניטריל 2ml 60% TFA 0.1%.
    5. מדגם יבש למטה במהירות VAC.

ההיפוך חלוקה בידוד פפטיד של Phosphopeptides

  1. פפטידים הם מופרדים על עמודה HILIC. אנו משתמשים TOSOH טפו-Gel אמיד-80 4.6 מ"מ x 25 ס"מ עמודה אנליטית עם עמודה השומר. קחי את הזמן שלך עם הצעד הזה, להפעיל את העמודה עבור 2 שעות 90% בטווח ולאחר מכן שני מילויים ריק לפני טעינת המדגם שלך. העומס המרבי על עמודה בגודל כזה נחשב סביב XX, אנחנו בדרך כלל לא להעמיס יותר מ 5 מ"ג לרוץ.
  2. מרכך - 98% ACN/0.1% TFA
    מרכך ב - 2% ACN/0.1% TFA
    טען% 90 מעל 20 ", 90% עד 85% מעל 5", 85% ל -60% מעל גיל 40 ", 60% ל -0% במשך 5 ', 0% עד 90% על 5 ".
  3. קצב הזרימה הוא 1ml/min ושברים נאספו ב 2 מרווחי דקות החל 85% עד 60% שיפוע.
  4. שלב שברים כדי לצמצם את מספר שברים עד 10. שברים מוגברת צפויה להניב כיסוי גדול יותר של phosphoproteome.

העשרה של phosphopeptides

  1. Phosphopeptides מועשרים באמצעות PHOS בחירה ג'ל ברזל זיקה. אנו aliquot שרף iMac שלנו כדי למנוע הקפאת חזר הפשרה. הפוך את 50 ה-MLS של חומצה אצטית 250 מ"מ, 30% עומס פתרון ACN. תביאו את ה-pH ל -2.7 עם HCl. Resuspend כדורי ב μl 500 של פתרון העומס. בדוק pH, להתאים עם HCl או NaOH במידת הצורך.
  2. 200 Prewash μl של חרוזים iMac בעמודה המתאימה. אנו משתמשים עמודות ספין Molbiotec.
    הוסף 15 μl של slurry של 50% (ג'ל לטעון פתרון) לשבר כל אחד, דגירה דגימות עבור 30 "עם סיום סיבוב על הקצה. שמור את זרימת לניתוח.
  3. לשטוף דגימות 3 פעמים עם פתרון לטעון פעם אחת עם 500 μl מסוננים DH 2 O.
  4. פפטידים Elute עם 2-3 דק 'עם 400 μl של 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8.4) חיץ. העברה בקבוקון זכוכית.
  5. כדי להפוך לחומצה pH 3 עם חומצה פורמית μl 5 100%, הקפאה בחנקן נוזלי פלאש, מדגם יבשים למטה במהירות VAC.
  6. Phosphopeptides Resuspend ב μl 200 TFA של 0.1% ו - C18 נקי כמתואר לעיל. יבש את דגימות eluted במהירות VAC.
  7. Resuspend פפטידים ב 20 μl של חומצה פורמית 0.1%. שימוש 2 μl לכל ניתוח ספקטרומטר מסה או לפי הצורך.

הערות

במשך רוב פרוטוקול זה תהיה עבודה "עיוור". תמוגה התא יכול להיות פיקוח על ידי סופג המערבי מבחני ברדפורד או BCA, ואת מערכת העיכול טריפסין ניתן להעריך בקלות. העמודה HILIC יהיה נתן שמץ דומה לזה, או נתפס על ידי אחרים [1, 2] בהתאם מכונת כרומטוגרפיה נוזלית המשמשת. דוגמאות מנוטרים על ידי ספקטרומטריית מסה, מבחן דגימות שלך במחשבים זולים כגון LCQs או MALDIs לפני שהולכים מנתח העלות הגבוהה על דיוק מסה גבוהה, מכונת ברזולוציה גבוהה. לבסוף, אם אתה ייבוש מטה מדגם עם חומצה בו, להשתמש בזכוכית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול לשמש להפקת לפרסם דיפרנציאלי התווית שתי התרבויות עבור כימות מטרות.

עבור חלוקה השיטות הנפוצות ביותר הן על ידי חלוקה ג'...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר עשיר רוג'רס לקבלת סיוע טכני עם מנתח ספקטרומטריית מסה ודיונים מועיל, בני הזוג. רוב מוריץ, ג'ף Ranish ו חמיד Mirzai לדיונים מועילים.

עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי לבריאות של אקסלנס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Isotec™ L-ארגינין-13פחמן6,15N4Sigma-Aldrich608033
Isotec™ L-ליזין-15N2Sigma-Aldrich609021
GIBCO™ תמיסת סলাইন בבופר פוספט (PBS) 7.4 (ריכוז 10X) נוזלInvitrogen70011044
טבליות מעכבי פרוטאין סיגמא-פסט (SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets)Sigma-AldrichS8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific, Inc.78420
מטחנת כדורי Retsch PM100 Retsch20.540.0001
כלי טחינה מנירוקס (Stainless Steel) בנפח 125 מ"ל של RetschRetsch01.462.0148
עמודת Ultramicrospin C18קבוצת הקינוןSUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18WatersWAT043395
עמודה אנליטית TSK-Gel Amide-80 4.6 מ"מ x 25 ס"מTosoh Corp.13071זוהי עמודת הכרומטוגרפיה מסוג HILIC.
עמודת הגנה בקוטר פנימי (ID) של 4.6 מ"מ ואורך של 1 ס"מTosoh Corp.19021אנו ממליצים על עמודה הגנה זו כדי להאריך את חיי מדף עמודת ה-HILIC שלך.
PHOS-Select™ ג'ל זיקה לברזלSigma-AldrichP9740זהו שרף ה-IMAC. יש לחלק לאליקוואוטים (מנות) ולאחסן.

מקורות

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Urea
Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.