Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

סיכום

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.

פרוטוקול

תא צמיחה התקשורת

1. מושבה אחת של תאים BY4742Δarg4Δlys1 לילה 100 מ"ל מדיה עשירה כדי OD ₆₀₀ של זרע אז 1.0 לשתי התרבויות 1 ליטר של מדיום שמרים מינימלי (0.17% חנקן שמרים ללא בסיס אמוניום סולפט או חומצות אמינו, אמוניום סולפט 0.5%) המכיל מלא של חומצות אמינו, בתוספת L / 20 מ"ג של ארגנין נורמלי isotopically או כבד ⁽¹³ ג ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) ו ליזין ⁽¹³ ג ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. התאים גדלו במשך 18 שעות,....

דיון

שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול לשמש להפקת לפרסם דיפרנציאלי התווית שתי התרבויות עבור כימות מטרות.

עבור חלוקה השיטות הנפוצות ביותר הן על ידי חלוקה ג'.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Isotec™ L-ארגינין-13פחמן6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-ליזין-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ תמיסת סলাইন בבופר פוספט (PBS) 7.4 (ריכוז 10X) נוזל	Invitrogen	70011044
טבליות מעכבי פרוטאין סיגמא-פסט (SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets)	Sigma-Aldrich	S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
מטחנת כדורי Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
כלי טחינה מנירוקס (Stainless Steel) בנפח 125 מ"ל של Retsch	Retsch	01.462.0148
עמודת Ultramicrospin C18	קבוצת הקינון	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
עמודה אנליטית TSK-Gel Amide-80 4.6 מ"מ x 25 ס"מ	Tosoh Corp.	13071	זוהי עמודת הכרומטוגרפיה מסוג HILIC.
עמודת הגנה בקוטר פנימי (ID) של 4.6 מ"מ ואורך של 1 ס"מ	Tosoh Corp.	19021	אנו ממליצים על עמודה הגנה זו כדי להאריך את חיי מדף עמודת ה-HILIC שלך.
PHOS-Select™ ג'ל זיקה לברזל	Sigma-Aldrich	P9740	זהו שרף ה-IMAC. יש לחלק לאליקוואוטים (מנות) ולאחסן.