מאמר שיטה

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

16.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1489

⸱

21 בינואר 2010

 ,  , 
1Biological Engineering, Brain and Cognitive Sciences, and McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

בקרה וניתוח של מעגלים עצביים In vivo יהיה בהנחיית טכנולוגיה עבור משלוח של וירוסים ריאגנטים אחרים 3 ממדי הרצוי סטים של אזורים במוח. אנו מדגימים אישית fluidic מזרק מערך ייצור, ואספקה ​​של virally בקידוד לרגישות אופטי, המאפשר מניפולציה אופטית של מעגלים חשמליים במוח ומורכב.

תקציר

ההבנה שלנו של מעגלים עצביים - איך הם לתווך חישובים תחושה המשרתים מחשבה, רגש ופעולה, וכיצד הם פגומים ב הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות - יהיה הקל מאוד עבור במהירות המיקוד גנים 3 מורכבים על ידי טכנולוגיה - מעגלים עצביים ממדי, המאפשר יצירה מהירה של "מעגל ברמה transgenics". לאחרונה פיתחנו שיטות שבו וירוסים קידוד רגישים לאור חלבונים יכול לרגש סוגי תאים מסוימים כדי הפעלת אלפית השנייה, זמנים ואת ההשתקה במוח שלם. כאן אנו מציגים את תכנון וביצוע של מערך מזרק מסוגל לספק וירוסים (או נוזלים אחרים) לעשרות נקודות מוגדר בתוך מבנה 3 מימדי של המוח (

פרוטוקול

1. בניית קלאמפ Stereotaxic

  1. מהדק stereotaxic משמש לחיבור מערך מזרק אל stereotax, כך הם מרססים במקביל הזרוע stereotaxic.
  2. כל מעבדה זקוקה רק אחד מהדק, אלא אם כן הוא צפוי כי יותר מפעם אחת הניתוח יכול להתבצע בו זמנית. במקרה זה, לעשות את אותו מספר כמו המספר המקסימלי הצפוי של ניתוחים בו זמנית. זה יכול להיות גם רצוי לבצע נוסף, במקרה של נזק הראשונה.
  3. כדי להפוך את מהדק stereotaxic, ראשית, בקוטר חיצוני 1.5 מ"מ (OD) פלדה צינורית היא לחתוך 2 ס"מ באורך, אחד מסתיים הוא Dremeled מטה עד שטוח.
  4. בשלב הבא, חתיכה קטנה (כ 0.5 x 0.5 ס"מ) הוא לגזור של PCB אב - לוח, כדי לשמש כשומר רווח.
  5. בעזרת חותך לייזר על מנת להבטיח כי כל הקיצוצים שנעשו הן בניצב לפני השטח של החומר, שני מלבנים זהים (1 / 2 "x 3 / 8") נחתכים מתוך יריעות "1 / 8 אקריליק, כל מלבן שיש שני חורים עגול פינות השני של המלבן. החור הראשון בקוטר 1.5 מ"מ, והוא פשוט גדול מספיק כדי להכיל את הצינורית מתכת חזק. החור השני יש בקוטר 1 / 16 "(תרשים 1C).
  6. צינורית המתכת מוכנס לתוך חור 1.5 מ"מ של מלבן אחד, ואז דרך חור 1.5 מ"מ של השני. הקצה התחתון של הצינורית הוא מתואם עם הפאה התחתונה של המלבן התחתון, יוצרים צורה של מקל הוקי.
  7. תוך שמירה על spacer בחוזקה בין שני מלבנים, מבנה זה הוא דבוקים זה לזה באמצעות דבק חם סביב החורים צינורית ו 1.5mm, להיות זהיר, כדי למנוע הדבקה spacer על מלבנים. פלסטלינה עשוי להיות מועיל להחזיק דברים יחד בתהליך זה.
  8. לאחר הדבק התייבש, בורג 1-72 מוכנס לתוך החור 1 / 16 מן הצד העליון של המלבנים. ואז אגוז 1-72 hex מוברג על סוף בורג 1-72, והידק. בורג אגוז לשרת להחזיק את מהדק יחד.
  9. כדי לצרף את אגוז hex להתמודד התחתונה של המלבן התחתון, כמויות קטנות של אפוקסי 5 דקות הם ירדו מסביב לקצה של אגוז hex, מבלי לאפשר אפוקסי להיכנס הנושאים של אגוז את הבורג או hex. חימר כל דוגמנות מוסר, והוא אישר כי spacer יכול להיות מוחזק במקומו על ידי הידוק בורג.

2. הכנת המערכת עבור מערך מזרק אישית: המילטון המשאבה stereotax

  1. מערכת ההזרקה מערך יכול להיות מותאם אישית כדי להגדיר כמעט כל הקואורדינטות במוח.
  2. מאתרת המשתמש הראשון הקואורדינטות של אתרי הזרקה הרצוי בעכבר (או מינים אחרים) אטלס המוח, המרת הקואורדינטות המתאימות בשימוש על ידי stereotax (כאן, ה-X,-Y, ו-Z קואורדינטות). מספר אתרי הזרקה (שלוש דמויות 1A ו-1B) יהיה להלן ייקרא k.
  3. מספר k של 10 מזרקים μl המילטון ממוקמים משאבת הזרקה / נסיגה מזרק כגון זו של מנגנון הרווארד.
  4. בשלב הבא, 3 באורך חתיכות של צינורות פוליאתילן מחוברים באופן מאובטח מחט של מזרק אחד המילטון.
  5. עבור כל קטע של צנרת פוליאתילן, ה-F-252 שרוול צינורות מאפצ'רץ' המדעית היא החליקה על סוף פתוח מצורף מתאם P-627 צינורות באמצעות אגוז כלול טבעת חזוק, גם מאפצ'רץ' מדעי.

3. בניית מערך מותאם אישית Injector

  1. כל מערך ההזרקה מותאם אישית כדי להגדיר את הקואורדינטות שהמשתמש בוחר. עם זאת, עבור זוגות של קואורדינטות שונים רק על ידי ותרגום / או רוטציה, מערך באותו מזרק ניתן להשתמש.
  2. בהתחשב רק קואורדינטות X ו - Y יחסית של אתרי הזרקה, חורים k הם קדחו לתוך לוח פרוטו-PCB בעובי של 1 / 32 ", עם מרווח יחסית זהה. אלה הם קדחו חורים באמצעות טחנת מיני Modela ו .011" קוטר לקדוח קצת מן מקמאסטר-קאר. הקפד להשתמש בקצב איטי של הקידוח (Z-מהירות) כדי למנוע שבירה או לובש את המקדח. לפני הסרת הלוח מן הטחנה, מלבן הוא קדח חורים קטנים מסביב, באמצעות המקדח גדול בקוטר של 1 / 32 ", כדי להימנע לובש את אחד קטן קוד עבור טחנת מיני יכול להיווצר בקלות באמצעות MATLAB:. מדגם קוד הניתן את הקבצים הבאים.
    1. generate.m - MATLAB הקוד ליצירת קוד Modela מן הקואורדינטות הרצויה
    2. holes_ex.rml - קוד Modela עבור דפוס טבעת קידוח (שמונה חורים) חזרה ללוח ל-הפרוטו
    3. outline_ex.rml - קוד Modela עבור מלבן סביב קידוח חורים
  3. 245 מיקרומטר OD/100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) צינורות סיליקה התמזגו נימי, זמינים Polymicro טכנולוגיות, הוא חתך לתוך מספר k של 3 אינטש חתיכות. אלה מהווים את מרססים בודדים. חתיכת הפנויה של צינור נימי הוא פישפשכל החורים, כדי לסלק פסולת ללא סתימת מרססים בפועל. מרססים מוכנסים אז באמצע הדרך לתוך כל חור, כך שהם מוחזקים בחוזקה במקביל אחד לשני. מרססים הם epoxied לעלות, יוצרים את המבנה של מערך מזרק. כל שנותר הוא לקצץ את מרססים לאורך הנכון.
  4. מערך מזרק מצורף מהדק stereotaxic ידי הצבת פינה אחת של לוח פרוטו בין המלבנים אקריליק, ולאחר מכן על ידי הידוק בורג של מהדק stereotaxic. לאחר מכן, צינורית המתכת של מהדק מצורפת stereotax, באמצעות מנגנון ההתקשרות של stereotax.
  5. כל אחד מאלה נעשית תחת מיקרוסקופ. עבור אחד מרססים החיצונית (כלומר, כזה ניתן לגשת מהצד עם קצה ישר, בלי להיתקל באף אחד מרססים אחרים), המשתרעת מעבר לקצה התחתון של לוח פרוטו הוא לגזור במספריים. עבור זריקות קליפת המוח, ראוי להיות מזרק המשתרע כ 5mm מעבר לפני השטח של לוח פרוטו. עבור זריקות עמוק יותר, מספר זה יכול להיות מוגברת על ידי גידול המקביל לעומק. קצה הוא שטוח עם כלי Dremel. טיפים Injector יכול להיות גם באדמה בזווית כאמצעי זהירות נוסף נגד סתימת, אם דיוק בעומק פחות חשוב.
  6. בשלב הבא, נקודת התייחסות יציבה נבחר בטווח של הזרוע stereotaxic, ואת מערך מזרק מועבר כך קצה שטוח של ההזרקה החיצונית, בנקודה זו התייחסות.
  7. מזרק השני הוא נבחר, יחד עם הקואורדינטות המתאימה. נחשב ההבדל יחסית גובה (Z-הכיוון) בין קואורדינטות הראשון והשני מזרק. מערך מזרק הוא נע לאורך ציר Z ידי מרחק זה יחסי. ההזרקה השנייה גזוז Dremeled באורך הנכון, כך הטיפ של ההזרקה השנייה היא עכשיו שטוחים בגובה של נקודת התייחסות. מערך מזרק ניתן להעביר את X ו Y כיוונים כדי להקל על ההשוואה בין קצה מזרק עם נקודת התייחסות.
  8. תהליך זה של זמירה חוזרים עבור מרססים הנותרים.

4. הרכבת המערכת כולה

  1. מהדק stereotaxic אישית מערך ההזרקה, הן נבנו כבר, נדרשים עבור חלק זה.
  2. בקצה האחורי של כל מזרק (סוף כי לא היה גזוז) מוכנס לתוך כחול F-240 שרוול צינורות, באמצעות אגוז P-235 ו-P-200 טבעת חזוק מאפצ'רץ' מדעי, מצורף מתאם מושחל כבר מחובר כדי לשאוב את המילטון על ידי צינורות פוליאתילן. הוראות היצרן ניתן להתייעץ לפרטים.
  3. באמצעות מחט 27-מד, שמן סיליקון מוזרק לתוך האחורי של מזרקים המילטון כך את המערכת כולה מלאה מן המזרק המילטון להטות את ההזרקה, ללא בועות אוויר בכלל.
  4. כמו מזרקים המילטון הם מחדש להציב משאבה המילטון, בהיקף הגדול ביותר האפשרי של שמן סיליקון נשמרת המזרקים.
  5. אם הניסוי דורש מזרקים יותר את המשאבה מיועדת (שניים במקרה הזה), מזרקים יכולה להיות מחולקת עם חתיכות קטנות של פלסטיק (לדוגמא, כמוסות מחט) כדי לשמור אותם במקביל זה לזה, על מנת להבטיח כי כל החלקים נמצאים נדחף על ידי המשאבה באותה מידה. או, רב מתלה שדרוג ערכת ניתן לרכוש מתקן הרווארד להחזיק עד 10 מזרקים בבת אחת.

5. זריקות / ניתוח

  1. תהליך של הזרקה עם מזרק מקביל דומה מאוד לזה של הזרקת עם פיפטה אחת.
  2. זה חיוני כדי להשתמש למילוי איטי / להחדיר שיעורי לאורך כל התהליך הזה, כי מהר שאיבה עשוי לשים דגש על המשותף בין צינורות גדולים וקטנים. מומלצים שיעור מרבי: 2 μl / דקה לטעינת וירוס, 0.1 μl / דקה עבור יציקת וירוס.
  3. עכבר הרדים ממוקם stereotax, ונשאר מורדם במהלך הניסוי.
  4. הכינו את העכבר לפי הצורך. לדוגמה, עם אזמל, חתך אחד הוא עשה את קו האמצע של העור, החל בין העיניים אל בין האוזניים. העור הוא נסוג לאחור כדי לחשוף את הגולגולת, ואת fascia הוא ניקה. פיפטה כוס משך מצורפת stereotax. עמדות הברים האוזן מותאמים עד גבחת ו למבדה מיושרים באותו הגובה, כך שקו הקושרות אותם מקביל לציר ה-Y של stereotax. צירים של stereotax מכוונים בהתאם למערכת הקואורדינטות שבה הקואורדינטות הזרקת להיות מחושב. Stereotaxic הוא התביית עם קצה פיפטה זכוכית גבחת, ולאחר מכן את קצה ממוקם מעט מעל הגולגולת ב-X ו-Y קואורדינטות של אחד האתרים ההזרקה.
  5. בעזרת מקדח שיניים, הגולגולת מתחת לקצה הוא pared בזהירות עד שלא נשאר שכבה דקה מאוד של העצם. פיפטה זכוכית יכול להיות נמוך יותרעורך וגדל לבדוק את החור שנקדח הוא מרוכז במיקום הנכון. באמצעות מחט 30-מד, חתיכה זעירה של השכבה הוא הרים בעדינות את, ב-X ו-Y קואורדינטות נכונה, כך מאטר הדורה חשוף. חור זה צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים אחד מרססים (0.25mm רחב). ראה איור 1D עבור דיאגרמה. בדרך זו, קטן, חורים רחב 0.25mm עשויים בגולגולת, ב-X ו-Y קואורדינטות המתאים לאתר כל זריקה.
  6. פיפטה הזכוכית נמחקת במיכל החדים, ואת מערך אישית מזרק מצורף stereotax באמצעות מהדק stereotaxic.
  7. כדי להגדיר נכונה את הזווית של המערך מזרק, שני מרססים החיצוניים נבחרים להיות מכויל נקודת התייחסות נתונה, כדלקמן. אחרי אחד המזרקים משתווה עם נקודת התייחסות, לשקול את ה-X ו-Y יחסי המרחקים בין אתרי הזרקה יחסית זה מזרק אחד אחר. צירים של stereotax מותאמים כך כל מערך מזרק מועבר ב-X ו-Y בכיוונים אלה מרחקים יחסית. אם ההזרקה השנייה לא מיושר עכשיו עם נקודת התייחסות, צינורית המתכת הוא התיר וסובב. תהליך זה חוזר iteratively עד מערך ההזרקה היא זווית נכונה.
  8. לפני מילוי מרססים עם וירוס, מרססים מלאים שמן סיליקון עד מזרקים נמצאים בשלב 2 μl (או יותר). זה מספק אזור חיץ, כך שכל בועות אוויר או סתימת בקצה ניתן להסיר בקלות על ידי לחיצה הנפט קדימה באמצעות משאבת המילטון, מבלי למלא את המערכת כולה עם שמן סיליקון מהחלק האחורי של מזרקים, כמו לתאר בעבר.
  9. חתיכת סטרילית של Parafilm מושם על הגולגולת, ואת מרססים הם הוריד בעדינות על Parafilm. עבור קואורדינטות עם עומק שונות מאוד, חלק הסתובבו אישית (למשל, חפץ דמוי מדרגות) יכול להקל על הטעינה.
  10. החלקים הבאים להניח כי 1 μl של הנגיף היא להיות טעון בכל אתר (הכמויות הבאות צריך להיות scaled למטה אם כמויות קטנות הן הרצוי). על מנת להבטיח כי> 1 μl של הנגיף מוזרק בכל אתר, 1.5 μl של הנגיף היא pipetted על Parafilm או גרם מדרגות בקצה של כל מזרק.
  11. עם קצב המילוי של המשאבה המילטון מוגדר μl 1 / דק ', 1.2 μl של הנגיף הוא מילא את כל מזרק.
  12. טיפ של מזרק הארוך ביותר הוא התביית על גבחת, ולאחר מכן את המערך מזרק הוא עבר ה-X ו-Y קואורדינטות של זה מזרק. אם סתימת סוגיה, לומר אם מטרות עמוק רבים מעורבים: אפילו לפני הכנסת טיפים מזרק לתוך המוח, לפעמים רצוי להתחיל את יציקת המשאבה, עד וירוס ניתן לראות העולה מתוך כל הטיפים מזרק. זו מסירה את כל בועות האוויר בקצות ההזרקה, וגם מבטיחה כי יש סתימת לא. במקרה של סתימת, המשאבה המילטון מוגדר להזרים פולס קצר במהירות גבוהה יותר של μl 2 / min, בעדינות כדי לנקות את החוסם.
  13. מערך מזרק הוא הוריד ואז, דרך החורים הקטנים שנעשו עם 30-מד מחטים, אל עומק-Z הנכון.
  14. 1 μl של הנגיף מוזרק באמצעות מזרק אחד, ב 0.1 μl / min.
  15. הזריקות נותרים לבד במשך 30 דקות.
  16. לאחר ההזרקה מערך מופק לאט מהמוח, המשאבה המילטון מוגדר להחדיר באותו קצב של μl 0.1 / דקה, כדי לבדוק סתימת בכל מזרק.
  17. ואז מרססים מנקים על ידי מילוי ו יציקת 1.5 μl של אתנול ב μl 2 / min.
  18. לבסוף, מרססים הם ומילא עם שמן סיליקון כדי לשמור על אזור חיץ 2 μl בתוך מזרק אחד המילטון.
  19. כל הציוד צריך להיות מעוקר לפני ואחרי הניתוח, על פי מוסד biosafety שלך ופרוטוקולים חיה להשתמש.

6. נציג תוצאות

מערך מקביל ההזרקה מאיץ את ניתוח בערך פי שווה למספר של מרססים, לא כולל התקנה זמן התאוששות, אם כי פעמים בודדות יהיה תלוי במיומנות של המטפל. עבור זריקה 1 microliter, אנחנו בדרך כלל ראה ביטוי lentivirus בתחום בקוטר של כ 1mm (איור 1E). הדיוק של הזריקה היה כזה משונות מיקום קצה, ממשפט למשפט, היה כ 45 מיקרון (סטיית התקן של המרחק מהמיקום קצה עמדת קצה המיועד).

figure-protocol-1
באיור 1. עיצוב, יישום, ושימוש מערך מקביל וירוס ההזרקה. סכמטית, של מערכת ההזרקה במקביל מערך, מראה תצורה משולשת מזרק, במשך שלוש זריקות סימולטני. B, תצלום של מערך משולש מזרק במקביל ניתח כמו . C, מהדק stereotaxic, המוצג המתאר מלמעלה D, איור של טכניקה יעילה, מזעור נזקים, פתיחת חורים בגולגולת עבור מזרק הכניסה לתוך המוח:. עם מקדחה של רופא שיניים, רזה הגולגולת עד עובי ~ 50 מיקרון, ולאחר מכן להשתמש קצה מחט חדה לפתוח craniotomy קטן. E, תמונה הקרינה מראה channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP שכותרתו תאים בשלושה אזורים בקליפת המוח העכבר, ממוקד כמו מזרק על ידי מערך משולש שמוצג ב

דיון

בשנים האחרונות, מספר מקודדים גנטית לרגישות אופטי אפשרו נוירונים להיות מופעל השתיק in vivo באופן temporally מדויק, בתגובה פולסים קצרים של אור (למשל, 1,4,5,6,7,8 , 11). מפתח שיטה שבה הנוירונים היה רגיש לאור במוח של יונקים, היא באמצעות וירוסים כגון lentiviruses ו adeno הקשורים וירוסים (AAV), אשר יכול להעביר גנים קידוד עבור opsins אל מוחם של בעלי חיים, החל עכברים וקופים, ב אופנה בטוחים ויציבים (למשל, 2,9,10). וירוסים לאפשר זמן תגובה מהיר יותר מאשר לעשות transgenics, במיוחד עבור אורגניזמים שאינם אורגניזמים מודל גנטי כגון חולדות וקופים, ועל opsins עשוי לאפשר רמת ביטוי גבוהה כי לא ניתן בתרחישים מהונדס. כאן אנו מדגימים מערך מקביל מזרק מסוגל לייצר, תוך לוח זמנים מהיר, "מעגל ברמה transgenics", המאפשר כולה 3 ממדי מבנים במוח להיות ממוקד virally עם הגן, בשלב ניתוח יחיד. המערך כולל מזרק אחד או יותר משאבות ספיקה שכל כונן סט של מזרקים, שכל אחד מהם הזנות לתוך סיליקה התמזגו-polyimide / נימי באמצעות מחבר בלחץ גבוה, סובלני. נימים הם בגודל, ונוסף אז אל, במקומות הרצויים שצוין על ידי אישית כרסום לוח מיצוב stereotactic, ובכך מאפשר וירוסים או חומרים כימיים אחרים כדי להיות מועברת להגדיר את הרצוי של אזורים במוח. כדי להשתמש במכשיר, המנתח הראשון ממלא את המשנה fluidic לחלוטין עם שמן, backfills הנימים עם הנגיף, מחדיר את המכשיר לתוך המוח, ממלאה ריאגנטים לאט (<0.1 μL / min).

טכנולוגיה זו תאפשר מגוון רחב של סוגים חדשים של ניסויים, כגון כיבוי אלפית השנייה, זמנים של המושלמת בצורת מבנים (כגון ההיפוקמפוס) בזמנים מדויקים במהלך התנהגות, איון temporally מדויק של מבנים דו שעשויים לפעול מיותר (כגון האמיגדלה על ימין ועל שמאל), ואת ההפרעות של מספר אזורים במוח בדידים (למשל, נהיגה שני האזורים מחוברים מחוץ שלב ללמוד איך האזור צולבות בתיאום תלוי הפעילות בכל אזור, או מגרה כניסות לאזור תוך השתקת קבוצת משנה של מטרות כדי להבין איזה מספר מטרות הן קריטיות עבור מתווך את ההשפעות של תשומות אלה). עבור מוחות גדולים כמו אלה הפרימטים, שבו יש לנו הפגינו לאחרונה ההפעלה אופטי תאים עצביים סוג מסוים 3, מביך הפעילות בתחום התנהגותית הרלוונטיים עשוי לדרוש תיוג ויראלי של מבנים גדולים ומורכבים. נציין כי במקביל מערכי מזרק ניתן להשתמש כדי להזריק כמעט כל מטען - סמים, neuromodulators, נוירוטרנסמיטורים, או אפילו תאים - ב 3-D דפוסים מורכבים במוח, באופן מדויק ובזמן. לבסוף, מבחינה translational, יתכן מהירה, המטופל אישית ריפוי גנטי או מסירה מכשירים התרופה עשויה להיות מהירה אישית מעוצבת ו מפוברק כדי להתאים הגיאומטריות מוח בודדים, תמיכה לטיפולים חדשים עבור מגוון רחב של פתולוגיות, באופן פוטנציאלי באמצעות מולקולות בקרה אופטית.

מערכים מזרק נועדו להיות מדויק, הן מרחבית volumetrically. ב-X ו-Y הכיוונים, זה נעשה על ידי קידוח חורים מאוד למקם במדויק באמצעות זול מיני הטחנה, עם חורים גדולים מספיק כדי להתאים את מרססים, כך מרססים מוחזקים במקביל זה לזה, וגם מדויק מיקום. בכיוון-Z, מרססים הם גזומים באמצעות מנגנון stereotaxic, מה שמאפשר רמת דיוק שווה ערך לזה של הניתוח stereotaxic עצמו. הדיוק נפח העולה מן הדיוק של המשאבה המילטון, כמו גם כמעט אפס מת נפח מחברים, עיבוד כרומטוגרפיה בלחץ גבוה הנוזל (HPLC) שדה. מרססים עשויים צינורות סיליקה התמזגו נימי, שהוא חזק ונוקשה מספיק כי הוא שומר על צורה מדויקת המרווח תחת לחץ, ללא עובי קיר גדול של חלופות כגון cannulas פלדה. שינויים קטנים יכולים בקלות להיות עשוי להתאים את מערך מקביל מזרק מגוון של ניסויים. לדוגמה, אם נפח קטן יותר של וירוסים או ריווח עדין נדרש, צינור נימי קטן יכול להיות מועסק, יחד עם המקדח המתאים קטן יותר. מכשירים עתידיים עשויים לנצל את ערוצי microfluidic משאבות, כדי להגדיל את מספר מרססים במקביל, כדי למזער את גודל (אולי המאפשר מכשירים כאלה להיות מותקן על ראשיהם של בעלי החיים נעים באופן חופשי).

גילויים

כל ההליכים היו בהתאם מדריך NIH עבור בחיות מעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים-MIT השתמשו ועדות biosafety.

תודות

ESB מודה מימון על ידי פרס ממציא ניו המנהל של NIH (DP2 OD002002-01), NIH אתגר גרנט 1RC1MH088182-01, NIH גרנד הזדמנויות גרנט 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 ו - 0,848,804), מכון מקגוורן תוכנית Neurotechnology פרס , משרד ההגנה, NARSAD, פ אלפרד סלואן קרן, ג'רי מארג' ברנט, פרס המחקר SFN עבור חדשנות Neuroscience, מעבדת המדיה ב-MIT, קרן Benesse ו ח 'וולאס קולטר קרן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלי דרמלכליDremel3956-02
חותכן לייזרכליUniversal Laser SystemsVLS2.30
אקדח דבק חםכליStanley BostitchGR20
משאבת מזרקים להזרקה/שליפה (משאבת Hamilton)כליHarvard Apparatus702001
10 μמזרקים מסוג HamiltonכליHamilton Co701Nדרוש אחד לכל נקודת הזרקה
סטריאוטקס לעכבריםכליStoelting Co.51725D
מיני-טחנה מדגם ModelaכלירולאןMDX-15
0.011" קוטר מקדח עבור מיני-מיל (mini mill)כליMcMaster-Carr8915A12
1/32" מקדח בקוטר עבור מיני-מיל (mini-mill)כליMcMaster-Carr8848A35
מקדח שיניים במהירות גבוההכלילינקס333
אביזרים למקדחה דנטליתכליהערכות פירסון (Pearson Assessments)F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
קנולה מפלדת אל חלודה בעלת קוטר חיצוני (OD) של 1.5 מ"מחומריםSmall Parts, Inc.HTX-15R
בורג מכונה בעל חריץ להורגב, 1-72חומריםSmall Parts, Inc.MX-0172B
אום משושה 1-72חומריםSmall Parts, Inc.HNX-0172
לוח מעגלים מודפס (PCB) לבניית אבות-טיפוס, 1/32" עבהחומריםDigi-KeyPC57-T-ND
לוח אקרילי, 1/8 אינץ'" עבהחומריםMcMaster-Carr8560K239
מחברי HPLCחומריםUpchurch ScientificF-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (חלק מאלה ניתנים לרכישה במארזים של 10; פשוט הוסיפו את ‘מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.’ עד לסוף מספר החלק)דרוש אחד לכל הזרקה לכל אתר, למעט F-252, P-627 ו-P-235, שניתן להשתמש בהם שוב
צינור נימי מסיליקה מותכת, קוטר חיצוני: 245 μמ', מזהה: 100 μמ'חומריםPolymicro Technologies2000022-10M
אפוקסי רב-תכליתי בעל זמן ייבוש של 5 דקותחומריםPermatex84101אפוקסי רב-תכליתי בעל זמן ייבוש של 5 דקות
צינור פוליאתילן 0.066 x 0.095 אינץ'חומריםVWR international63018-827

מקורות

  1. Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).
  2. Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 50, 23-33 (2006).
  3. Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain. Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).
  4. Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).
  7. Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
  8. Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  9. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).
  10. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  11. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.