RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

סיכום

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד ב תסיסנית עין. אנו פרט מתודולוגיה דיסקציה של הדיסק עין דמותי ואיך זה הכתב יכול לשמש כדי לסייע לנתיחה וזיהוי של סוגי תאים מסוימים בעין מתפתחות.

פרוטוקול

1. מקום ראשון ירידה של PBS על צלחת Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתח.
2. הבא להסיר מספר הזחלים נודדים instar השלישי בקבוקון או בקבוק בעזרת מרית ומניחים אותם PBS.
3. לנתיחה כדי להתחיל את השימוש פינצטה ביד שמאל (אם אתם ימניים) לאחוז הזחל שני שלישים של הדרך לכיוון אחורי ולאחר מכן להשתמש זוג אחרים להחזיק את הפה ווים בצבע כהה בקצה הקדמי.
4. כעת משוך בעדינות את הזחל בנפרד על ידי הזזת שני זוגות של פינצטה אחד מהשני. גפי צריכה לבוא משאר הגוף עם מורכבות העין / המוח המצורפת.
5. כדי להכתים את הדיסקים עין immunofluorescence לתקן את הדיסקים בשלב זה על ידי הצבת אותם paraformaldehyde 4% / פתרון PBS עבור 30-45 דקות על הקרח. ואז לשטוף את הדיסקים ארבע פעמים עם PBST ואת כתם אז עם נוגדנים מתאימים.
6. זה הכי קל לנתח את העין הדיסקים ישירות בשקופית. מניחים ירידה של PBS בשקופית ולעבור את הדיסקים לירידה של PBS על ידי החזקת גפי.
7. הרקמות דמותי הם שקופים ולכן בהתחלה את הדיסקים עין קשה לזהות. כדי להקל לזהות אותם במיקרוסקופ לנתח עם יכולת פלואורסצנטי. באמצעות העין RFP קו כתב דיסקים העין ניתן לראות בבירור כמו רקמה ניאון אדום שכיסה האונות אופטי כדורי (איור 1).
8. אם אתה משתמש מקור סיבים אופטיים אור קר לכוון את האור בזווית אלכסונית לשקופית, כמו זה ייתן את הדיסקים ניגוד גדול יותר. דיסקים העין / מחושים מחוברים האונות אופטיים באמצעות גבעול הראייה בבית האחורי ואל גפי דרך גבעול הקרובים מדיסק מחושים בבית הקדמי.
9. כדי לנתח את הדיסקים עין להחזיק את גפי באמצעות אחד פינצטה ולהשתמש זוג אחר כדי להפריד את הדיסקים העין מהמוח הזחל. הבא להפריד את הדיסקים עין מן גפי. לבסוף להסיר את גפי משקופית כמו אלה יכול למנוע את coverslip מן שוכב.
10. כאשר יש לך גזור את כל הדיסקים העין בעדינות להטות את השקופית ויבש את PBS עודף. לאחר מכן להוסיף טיפת Vectashield בעדינות למקום coverslip על העליונה.
11. הדיסקים מוכנים כעת להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ או epifluorescence או confocal (איור 2).

נציג תוצאות

כאשר ניתח נכון את הדיסק העין / מחושים צריך לשכב בשקופית ברורה של רקמה כלשהי זרים כגון המוח. הקטבים הגבי ו הגחון של הדיסק עין מעוגלים, כך נוטים להתקפל, אבל זה יכול להימנע על ידי לקיחת Z-סדרת מיקרוסקופ confocal ו השמטת סעיפים אלה מן התחזית. אמנם הדיסק הוא אפיתל monolayer עמדות משתנה של גרעיני דורשים הקרנת Z-סדרת לקבל תמונה כוללת של הדיסק. השלכה של העין העין RFP טיפוסי / דיסק מחושים לקחה על מיקרוסקופ confocal מוצג באיור 2. אנחנו בדרך כלל לוקח 1 סעיפים מיקרומטר דרך הדיסק באמצעות עדשה 20x או 40X. הכתב העין RFP הוא מקומי גרעיני ולכן דפוס ראו תרשים 2 מייצג את הגרעינים של תאים לבטא RFP.

באיור 1. דיסקציה ראשונית של העין / המוח מורכב מ הזחל עין third-RFP תסיסנית instar. העין / דיסק דמותי מחושים (בקווים כלליים) ניתן לראות המחוברים גפי (MP) ו שכיסה האונה אופטיים (OL) של המוח. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח כדי להראות את הביטוי RFP דיסק העין. Anterior היא שמאלה. בר קנה מידה: 300 מיקרומטר.

באיור 2. הביטוי של עיתונאי העין RFP של הדיסק עין דמותי. העין השלישית instar (ED) / דיסק מחושים (AD) גזור מן הזחל העין RFP מראה RFP הביטוי (אדום). הדיסק היה מוכתם phalloidin (ירוק), אשר כתמי משטחים התא apical ומראה את תלם המוךפו"גנטי שהולך (ראש חץ). RFP מתבטא בתאים מבשר סביב MF, על photoreceptors 1,6,7 ו בתאי קונוס. Anterior היא שמאלה. בר קנה מידה: 25 מיקרומטר.

דיון

Dissection של הדיסק עין דמותי תסיסנית היא פשוטה, אבל יכול לקחת זמן כדי לשלוט. השלבים הקריטיים זיהוי של הדיסק העין לנתיחה שלה מן המוח הזחל. זיהוי של הדיסק העין נעשה קל יותר באמצעות קו העין RFP המתואר כאן. שינויים אפשריים הם להסיר את הדיסק מחושים או קרום peripodial, או לעזוב את האונה אופטיים המחוברים לדמיין את האקסונים יחסי ציבור הזנת המוח.

קו העין RFP נוצר על ידי שיבוט עין ספציפי רומן אלמנט משפר מן אינטרו...