תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

סיכום

אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

תקציר

רוד חרוט קולטני האור ברשתית אחראים לגילוי האור. בחושך, מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) ערוצי בקטע החיצוני פתוחים ולאפשר קטיונים לזרום פנימה בהדרגה על פני קרום, depolarizing התא. חשיפה לאור מעורר את סגירת הערוצים CNG, חוסם את זרימת קטיון פנימה הנוכחי, ולכן התוצאות hyperpolarization התא. בהתבסס על הקוטביות של קולטני האור, שיטת ההקלטה יניקה פותחה בשנות ה -1970, שבניגוד טכניקת התיקון-clamp קלאסי, אינו מחייב לחדור הממברנה הפלסמטית

פרוטוקול

ביצוע אלקטרודות

1. הפוך את האלקטרודות הקלטה באמצעות חולץ micropipette וללטש את האלקטרודות עם נימה חימום תחת מיקרוסקופ. להקלטת עכבר תא בודד חרוט יניקה, הקוטר הפנימי על קצה האלקטרודה הוא כ 6-7 מיקרומטר.
2. הכן אלקטרודות התייחסות. לשקול אגר 1% מים מזוקקים. ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו את pipettes זכוכית (L = 100 מ"מ, OD / ID = 1/0.75 מ"מ) עם אגר 1% באמצעות מזרק. לחזק את אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
3. חותכים את pipettes לחצאים באמצעות סכין יהלום.
4. משרים את האלקטרודות בתמיסה התייחסות התייחסות לפחות 24 שעות 4 ° C.

הגדרת הניסוי

5. Dark להסתגל עכבר בכלוב שחור לילה.
6. הכן 100 מ"ל התייחסות פתרון 1 זלוף L פתרון (ראה להלן) ולסנן את הפתרון.
7. ממיסים BSA 0.1% ו 10 מ"מ פתרון גלוקוז 20 מ"ל התייחסות.
8. כייל את עוצמת האור של ממריץ האופטי באמצעות פוטומטר.
9. הר קאמרית הקלטה על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה.
10. הבועה זלוף פתרון עם 95% O ₂ / 5% CO _2, דגירה אותו באמבט 40 מעלות צלזיוס מים כדי להגדיל את מסיסות _של CO2. הפתרון זורם מהבקבוק לתא הקלטה עובר דרך הנגד קרמיקה ההתחממות אותה 36-38 ° C. החימום צריך להיות ממוקם קרוב לתא הקלטה ככל האפשר, רצוי בשלב של המיקרוסקופ.
11. כוונו את ווסת הזרימה עבור קצב זרימה של כ 1-1.5 מ"ל / דקה.
12. מלאו את האלקטרודה פתרון ההקלטה עם הפניה. הכנס את אלקטרודה בעל אלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה. הר בעל על headstage של המגבר. חבר את מחזיק למכשיר שאיבה, אשר בנויה על ידי חיבור צינורות מלא חלקית עם שמן מינרלי לנמל בצד של בעל אלקטרודה. בקצה השני של הצינור מחובר מאגר קטן של שמן מינרלי, שבה הלחץ יכול להיות מיושם על ידי הפה.
13. חבר את האלקטרודה התייחסות הקוטב השני של headstage. Bind הזוג תרמית (TC) אל האלקטרודה התייחסות. ודא טיפים אלקטרודה TC הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב לתא האפשרי.
14. הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את האלקטרודה. אלקטרודה היא נצפים על ידי מצלמת אינפרא אדום המחובר לצג. במרכז התמונה אלקטרודה על שדה הראייה של המסך באמצעות מניפולטור מיקרו.
15. התאם את המיקום של קרוב אלקטרודה קצה הפניה (2-4 מ"מ) אל קצה האלקטרודה ההקלטה.
16. התאם את מתח DC עבור החימום כך את הטמפרטורה של הפתרון הוא על 36-38 ° C.
17. הפעל בדיקה חותם כדי לבדוק את ההתנגדות של האלקטרודה הקלטה, בדרך כלל על 900 kΩ.

בידוד הרשתית העכבר

18. תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר מותאם כהה עם CO ₂ ו נקע בצוואר הרחם. סמן את העיניים בעזרת קצה של לפיד מתכת לוהטת על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין מעט. Enucleate את העיניים בעזרת מספריים. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום.
19. Hemisect את העיניים תחת מיקרוסקופ עם תאורה אינפרא אדום וממירים התמונה.
20. הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר כמה שיותר הזגוגית האפשרי.
21. כדי להקליט M-חרוט התגובות, להסיר את החלק הגחוני של עיינית ⁴ בסכין גילוח אם לשפוט על פי סימן כויה.
22. פיל הרשתית מהשכבה אפיתל הפיגמנט.
23. שטחו את הרשתית ולשים אותו על החלק התחתון של צלחת פטרי מלאות פתרון מ"ל 1-2 התייחסות.
24. פורסים את הרשתית לחתיכות קטנות דק בעזרת סכין גילוח ו דגירה הכנת בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור.

הקלטות

25. כבו את התנור באופן זמני. החלף את זרימת זלוף אל צינור עוקף כדי למנוע את תא מהתייבשות.
26. מסננים את רוב הפתרון בחדר באמצעות פיסת רקמה Kimwipe. מעבירים את ההשעיה הרשתית לתא הקלטה בעזרת פיפטה מזכוכית.
27. המתן כ -2 דקות עד פרוסות הרשתית להתיישב. כבה את זלוף בחזרה. הפעל את החימום.
28. הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את ההכנה. חיפוש עבור פיסת של הרשתית שוכב על החדר עם פלחי photoreceptor החיצוני בולטות (ראה איור למשל). צייר חלקים פנימיים בעדינות לתוך האלקטרודה על ידי יניקה. בתצורה זו, כמה גרעינים וקטעי הפנימי צריך להיגרר האלקטרודה. הקלט את photoresponse להבהב בהיר כדי לבדוק אם קטע חרוט הפנימי הוא האלקטרודה והאם התא לרפאכמוך, אם לשפוט לפי התגובה קינטיקה משרעת.
29. מנמיכים את מאגר המינרלים להפעיל לחץ שלילי קל עד קצה האלקטרודה כדי לעזור להחזיק את פלח הפנימית האלקטרודה.
30. מבחן פלאש שיא ותגובות עמום לעוצמת בהיר פעם תא טוב נמצא. גלי מבחן ניתנים מתוך גירוי אופטי מכויל ^5. עוצמת פלאש הגל נשלטים על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי וצר התערבות מסננים הלהקה, בהתאמה. מבחן משך פלאש (20 מילישניות) נשלטת על ידי מחשב מונחה התריסים.

פתרונות

1. זלוף פתרון עכבר: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl _2, 1.2 mM CaCl _2, 10 HEPES מ"מ (pH 7.4), 20 mM NaHCO _3, 3 mM Na succinate, 0.5 mM Na גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז.
2. הקלטה עכבר פתרון אלקטרודה: 140 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl _2, 1.2 mM CaCl _2, 3 HEPES מ"מ (pH 7.4), 0.02 mM EDTA.

דיון

תא בודד הקלטה יניקה מן התאים קולטי האור פותחה 3 עשורים. זה מאפשר לנו להקליט קרום טרנס השינוי הנוכחי המושרה על ידי גירוי האור מבלי לחדור קרום התא. בגלל הידבקות תאים תאים גבוהה, קשה לבודד את מוט יחיד חרוט בריא מן הרשתית כמו עכבר הרשתית דוחי וקשה למצוא קונוסים בודדים בשל אחוז נמוך (3%) וגודל קטן. קטע הפנימית ב-(IS-in) שיטת הקלטה מתגבר על קושי זה על ידי הקלטה הנוכחי מן המגזרים הפנימי של photoreceptors כמה, ביניהם חרוט יכול להיכלל. בשנת העכבר סוג בר, התגובה צריכה להיות שילוב של מוטות ק...