כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

סיכום

QPCR הביטוי Solaris מבחני ג'ין הם הרומן תוכנן מראש פריימר / בדיקה qPCR שילובים שנועדו לפשט את תהליך qPCR מבלי להקריב את הספציפיות וחוסנם של assay.

תקציר

QPCR הביטוי Solaris Assay ג'ין הוא סוג חדש של קבוצת פריימר / בדיקה, שנועדה לפשט את תהליך qPCR תוך שמירה על רגישות ודיוק של assay. פריימר / בדיקה אלה סטים מוגדרים מראש שנועדו% 98> של הגנום האנושי עכבר ושיפורים תכונה משמעותית מטכנולוגיות זמין קודם לכן. שיפורים אלה התאפשרו בזכות אלגוריתם רומן העיצוב, שפותחו על ידי מומחים Thermo Scientific ביואינפורמטיקה.

מספר תכונות נוחות שולבו Assay Solaris qPCR כדי לייעל את תהליך ביצוע כמותי בזמן אמת PCR. ראשית, פרוטוקול דומה חלופות מועסקים בדרך כלל, ולכן השיטות במהלך qPCR צפויים להיות מוכרים. שנית, תמהיל הראשי הוא כחול, מה שהופך את ההגדרה תגובות qPCR קל יותר לעקוב. שלישית, התנאים רכיבה תרמית זהים עבור כל מבחני (גנים), כך שניתן להפעיל דגימות רבות בזמן וצמצום הפוטנציאל לטעויות. לבסוף, בדיקה ורצף מידע פריימר מסופקים, לפשט את תהליך הפרסום.

כאן, אנו מדגימים כיצד להשיג את ריאגנטים המתאימים Solaris השימוש במוצר GENEius החיפוש תכונה למצוא באתר האינטרנט של ההזמנה (www.thermo.com / Solaris) ואת אופן השימוש ריאגנטים Solaris לביצוע qPCR בשיטה עקומה סטנדרטית.

פרוטוקול

1. המדעית Thermo Solaris עיצוב qPCR Assay אלגוריתם

1. האלגוריתם משמש בעיצוב של Solaris qPCR בדיקה / פריימר זוגות אני מתאים את של כל רכיב ובכך לאפשר תנאים אופניים אוניברסלית. התאגדות של מג"ב, או קטין מחייב חריץ, מחצית בתוך החללית מגבירה את אני ומאפשרת בדיקות קצרות להיות מיועד assay גמישות רבה יותר וביצועים. כפי ששמה מרמז, MGBs הם סוג של אנטיביוטיקה שיכולה להשתלב חריץ הקטין של סליל ה-DNA. MGBs המצורפים בסוף 3 או 5 של בדיקה דנ"א. ב פתרון, פלואורסצנציה הכתב FAM של החללית הוא הרווה ידי מרווה Eclipse Dark. כאשר החללית נקשר ברצף היעד, וכתוצאה מכך לשנות קונפורמציה של בדיקה 3-D מאפשר אות ניאון חזק. עקידת לחקור את רצף ה-DNA היעד הוא התייצב על ידי מג"ב, אשר מאפשר את השימוש, בדיקות ספציפיות מאוד קצרים, תוך שמירה על טמפרטורת ההתכה מתאים PCR. לכן, זיהוי אות מתרחשת בשלב חישול של הגברה היעד. במהלך שלב ההארכה, בדיקה מג"ב disassociates ואת הקרינה הוא הרווה שוב. בגלל החללית disassociates, זה לא משפיע על יעילות ה-PCR.
2. מאפיין נוסף של האלגוריתם Solaris הוא השימוש Superbases. Superbases משתנים בסיסים שיש להם יכולות משופרות מחייב כדי לשפר את היציבות של AT אג"ח לחסל GG עצמית העמותה רצפים עשירים גואנן. יתר על כן, הם אינם סמוכים להרוות fluorophores מצורף בתחנה הסופית 5. בסיסים אלה ממוקמים באופן סלקטיבי, על פי האלגוריתם, כדי להרחיב את הזמינות של רצפי היעד. זה מאפשר להשתמש רצפים, כגון אזורים GC עשיר, שאחרת היה נמנע בעיצוב primers ו בדיקות.
3. במידת האפשר, את האלגוריתם Solaris משלבת אזורים אקסון צומת פורש באתר היעד. זה מגדיל סגוליות ידי הימנעות הגברה של הדנ"א הגנומי מזהמים.
4. חשוב לציין, האלגוריתם מזהה גם רצף קונצנזוס של כל גרסאות אחוי ידוע, כך שכל מכוסים על ידי בדיקה יחיד / קבוצה פריימר. לכן, רק אחד assay דרוש גן מסוים של עניין.
5. לבסוף, qPCR עיצוב Solaris אלגוריתם Assay מנצל פרמטרים מחמירים מאוד שיקולים עיצוב קריטי כולל תוכן אורך GC, אני, והוא משתרע של נוקלאוטידים הומוגנית. רצפים וכתוצאה מכך הם תפציץ ניתח עבור סגוליות 3 באמצעות מאגרי מידע שונים: גנומי, תמליל, ו pseudogene.

2. קבלת Solaris ריאגנטים

1. כדי להשיג את המתאים Solaris ריאגנטים, בקר www.thermo.com / Solaris
2. פעם באתר לחץ על "חיפוש GENEius המוצר". כדי לעבור ישירות לחפש את המוצר GENEius, ללכת www.thermo.com / SolarisSearch
3. לחץ בתיבת החיפוש חקירה ולבחור את האורגניזם היעד המתאים.
4. חיפוש מוצר GENEius יכול לעבד רבים מזהים גנים שונים. הנה, הזן אחד הציע מונחי חיפוש כדי למצוא את הגן של עניין, לרבות שופט Seq ההצטרפות, מזהה ג'ין, סמל ג'ין, תיאור הגן, את מזהה סנגר או מספר ההצטרפות, או מספר קטלוג. לאחר מכן, לחץ על "חיפוש".
5. זהה את הגן של עניין ולחץ על "בחר" בצד שמאל. פעולה זו תפתח חלון המציג את המוצרים השונים Thermo Scientific זמין עבור הגן של עניין. תחת "מוצרים" בחר את "qPCR איתור" Tab.
6. תחת "Assay Gene Expression סולאריס" הכותרת, תוכלו לראות את אחד מעוצב בצורה אופטימלית Solaris בדיקה / assay פריימר. זה assay אחד לא לכסות את כל גרסאות אחוי ידוע היעד הגן שלך. בחרו את הכמות הרצויה. הם זמינים 100, 200, 400, ו
   1000 X 25 תגובות μl (אם assay מזוהה עשה סדר, אל, את גודל חבילת 100 לא יהיה זמין). לחץ על "הוסף לסל".
7. הבא, בחר את תערובת אב מתאים Cycler התרמית אשר ישמשו. כדי לקבוע איזו תערובת מאסטר יעבדו הכי טוב עם המכשיר זמין, לחץ על "גלה אילו מיקס מאסטר עובד הכי טוב עם Cycler PCR שלך!"
8. מצא את Cycler qPCR אשר ישמשו בתפריט כדי לקבוע אילו לערבב לשימוש.
9. חזור אל חלון החיפוש המוצר GENEius, ובחר לערבב מאסטר המתאים. תמהיל המאסטר מגיע 100, 200, 400, ו 1000 גדלים התגובה. לחץ על "הוסף לסל".
10. גנים התייחסות המוצעות cDNA Verso ערכות סינתזה יכול להיות גם הורה לניתוח qRT-PCR להשלים.
11. כאשר qPCR ריאגנטים Solaris להגיע, לאחסן אותם ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. ריאגנטים הבאות צריכות להתקבל: פתרון 20X המכיל שני primers סיפק 800 nM כל אחד בדיקה גנים ספציפיים הניתנים 200 ננומטר, sequence מידע עבור בדיקה והן primers, ו-Solaris הביטוי qPCR ג'ין מיקס מאסטר בריכוז 2X. Solaris הביטוי qPCR מבחני ג'ין יציבים עבור מינימום של 12 חודשים. הימנע להקפיא חזר הפשרה.

3. qPCR ההתקנה

1. בגין פרוטוקול qPCR עם cDNA. RNA סה"כ צריך להיות חילוץ באמצעות שיטה טור ספין. מדעי Thermo ערכת cDNA Verso סינתזה מומלץ שעתוק לאחור כדי ליצור cDNA.
2. היכונו qPCR על ידי הפשרת primers, בדיקות, ומערבבים מאסטר על הקרח. כמו כן יש על יד מים PCR כיתה ו אטום צלחות qPCR לבן, אשר יכולים לשפר את הרגישות של ה-PCR בזמן אמת.
3. תמהיל מאסטר מכיל את כל הרכיבים בפעם PCR אמיתי כולל: פולימראז Thermo-Start 1) ה-DNA, גרסה חמה ההתחלה של פולימראז הדנ"א Thermoprime. סוג זה של פולימראז משמש למניעת הלא ספציפית הגברה במהלך התגובה, להגדיר דורש שלב ההפעלה על 95 מעלות צלזיוס 15 דקות. 2) dNTPs בתמהיל Solaris הורים, dTTP מחליף dUTP כדי למקסם את היעילות הגברה 3) המאגר התגובה קנייניות, מותאם לעבודה עם Solaris פריימר / מבחני בדיקה. זה חיץ תגובה מכיל צבע כחול כדי להגביר את הניגודיות בין מגיב ופלסטיק. 4) רוקס, אם המכשיר שלך דורש qPCR רוקס.
4. ברגע פתרונות יש להפשיר, לערבב ידי מצליף הצינור (לא מערבולת). ספין אותם כדי למנוע אובדן של מגיב.
5. בשלב הבא, להכין 15 מ"ל סטרילי צינור פלקון להגדיר את תערובת תגובה עבור הגן של עניין, ועוד אחד של הגן התייחסות, קנה המידה בהתאם למספר דוגמאות. הכינו מספיק כאלה כי שלושה משכפל יכול להיות מוכן מדגם זה, כולל שליטה אין תבנית (NTC) דגימות עקומת רגיל, אם שיטת עקומת סטנדרט ישמש לניתוח.
6. עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 96 היטב, לערבב את הדברים הבאים: 5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 0.5 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרונה, פעם cDNA הוא הוסיף יהיה 25 μL. עבור כל דגימה לרוץ על צלחת 384 לערבב היטב את הדברים הבאים: 12.5 μL של מיקס מאסטר 2X Solaris qPCR, 1.25 μl של קבוצת Solaris פריימר / בדיקה (20X), ומים PCR כיתה כזה כי היקף התגובה האחרון, לאחר cDNA הוא הוסיף יהיה 10 μL.
7. שימוש pipettor רב ערוצי, להעביר את תערובת מאסטר בארות המתאים הצלחת. צבע כחול הכלולים לערבב האב יסייע להתקדמות pipetting מעקב על הצלחות הלבנות. לאחר מכן יש להוסיף את תבנית 1-5 cDNA μL (עבור צלחת 96 באר) או 1-2 μL של תבנית cDNA (עבור 384 צלחת היטב). פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מניחים את צלחת בצנטריפוגה ספין למטה כדי להסיר בועות, כמו אלה יפריע בקריאה פלואורסצנטי.
8. תוכנית Cycler תרמי: האנזים חייב להיות מופעל עם 95 מעלות צלזיוס 15 דקות (1 מחזור). ואז 40 מחזורים של 95 ° C, denaturation למשך 15 שניות, חישול והסיומת ב 60 ° C למשך 60 שניות.
9. מניחים את הצלחת המכשיר qPCR. הפעל את התוכנית.

נציג qPCR התוצאות באמצעות Solaris

באיור 1. מבחני Solaris לתת זיהוי אמין גם בריכוזים נמוכים מאוד קלט, כמו להישפט על ידי היעילות PCR וערכים r2. עשר של פי 10 דילולים של cDNA מסונתז מתוך רצף RNA סינתטי amplicon או amplicon רצף הדנ"א היה מוגבר על מכשיר ABI 7900HT באמצעות Solaris הביטוי qPCR Assay ג'ין עבור F2RL1 או CDC20, בהתאמה. יומן בהיקף העיקולים הגברה ועקומות תקן מוצגים יחד עם הביצועים של כל assay כולל יעילות, ערך r2, טווח דינמי מתוך 10 LOG10 דילולים, ואת הגבול התחתון של זיהוי.

איור 2. מבחני Solaris לתת תוצאות עקביות אפילו בין חוקרים במעבדות שונות. siRNAs מיקוד ALDOA ו PPIB, כמו גם בקרת Non-מיקוד (NTC), היו transfected לתאי הלה ב nM 100, 10, 1 ו 0.1 ריכוזי הסופי. תאים נקצרו ו-RNA בודד הכולל 48 שעות שלאחר הטיפול. cDNA היה מסונתז באמצעות Thermo Verso מדעי cDNA ערכת סינתזה. Aliquot של cDNA היה מוגבר בשתי מעבדות מופרדים גיאוגרפית באמצעות Solaris הביטוי qPCR מבחני ג'ין לגילוי ALDOA, PPIB ו GAPDH על LightCycler רוש 480 (384 גם) פלטפורמה. מציאה חושבה בשיטת ΔΔCq (מנורמל ל GAPDH התייחסות גנים NTC שטופלו בתאים). רמות אותו מציאה היו הפגינו הן מטרות גנים בין שני החוקרים בשני האתרים.

דיון

Thermo Scientific Solaris מבחני qPCR לספק שיטה פשוטה, משופרת עבור ביצוע ניתוח qPCR. באמצעות אלגוריתם חומרה גבוהה, שילוב מג"ב טכנולוגיה Superbases, אלה קבוצות פריימר ועל בדיקה למקסם את נאמנות וחוסנם של ניסויים qPCR. אחת פריימר ולהגדיר בדיקה מזהה כל גרסאות אחוי ידוע של גן מסוים. אתר היעד, במידת האפשר, כולל אזורים אקסון פורש, על מנת להבטיח כי הדנ"א הגנומי לא מוגבר. תכונות אלה מאפשרות להריץ בו זמנית מספר רב של דגימות, מקטינים מאד את משך הזמן הדרוש כדי לבצע ניסויים מורכבים. מאז לערבב הראשי הוא כחול, אפשר להשתמש בצלחות אטום לבן, לשפר את הרגישות של qPCR, מבלי לאבד את תחושת pipetting.

Taken הכל ביחד, את התכונות העיצוב של Assay Solaris qPCR להפוך את זה assay assay qPCR רומן פשוט, אך בעל ביצועים גבוהים, כי הוא גם ספציפי וחזק.