Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

סיכום

וידאו זה מדגים את טכניקה המשמשת להכנת מארגן מוט explants חיים מעוברים Xenopus laevis, כולל שימוש בסכין גבה - כלי לנתיחה המקצועית עשוי גבה אחת. פרוטוקול להרכבת assay הידבקות ניתנת גם, אשר בדיקות נוכחות של מולקולות הדבקה המפתח הנוכחי על מארגן את פני השטח או מוט חיה התאים הם קריטיים להתפתחות תקינה.

פרוטוקול

הכנת לשכות הדבקה (יום לפני ההזרקה / דיסקציה)

Assay הדבקה צ'יימברס

אם יש לך מיקרוסקופ מתחם קונבנציונלי (מאתרת אופטי מעל הבמה), הוא ncecessary לבצע הדבקה נמוכה גובה קאמרית כדלקמן. אם באמצעות מיקרוסקופ הפוך אופטיקה, ואז "NUNC Lab-Tek Coverglass החדרים" יכול להיות בשימוש, לדלג על שלבים 1 - 2.

1. צרף אחד "מבדד עיתונאים חותם סיליקון" על פתק 40 x 24mm לכסות. היטב בעיתונות מבודדת להחליק את מכסה על benchtop נקי להסתכל מהצד השני כדי לוודא כי מבודדת מחוברת לחלוטין, ללא בועות אוויר.
   
   
2. אופציונלי: שים לתאי הידבקות בצלחת פטרי עם נייר זכוכית מסנן Whatman ו החיטוי במחזור יבש לעקר. מגניב אותם עד RT.

ציפוי הקאמרית

1. שים טיפה 200 מ"ל של עבודה פתרון של cadherin (10mg/ml) או פיברונקטין (20mg/ml) על במרכז החדר הידבקות autoclaved, באמצעות טיפים צהוב sigmacoated. לדגור על RT במשך 4 שעות.
   
   
2. קח את הפתרון cadherin או פיברונקטין והעברת צינור 1.5ml. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר במשך השבועיים הקרובים.
   
   
3. לוותר 500ml של BSA 4% 1x MBS-H לחסום את החדר. לדגור על RT במשך שעה 1.
   
   
4. לשאוב את הפתרון BSA. שטפו את החדר עם 500ml של 1x MBS-H פעמיים. לאחר לשטוף את השני, ישאפו רוב MBS-H (לא לגמרי), ולאחסן במכל אטום על 4 º C. זה תא הידבקות טובה עבור 2 הבא - 3 ימים.

Dissection ו דיסוציאציה של Explants שווי בעלי חיים

1. דגירה עוברים מוזרק 0.1x MBS-H, בדילול מן 1x autoclaved MBS-H, כלא autoclaved בינוני מתישהו נושאת חיידקים קטן שיכול להפריע כובע התאים ניתק בעלי חיים.
   
   
2. הפוך את agarose 1x בארת' של צלחות CMF-MBS agarose צלחות עם מנות 60mm, לפחות כמספר במספר דגימות שלך. יוצקים autoclaved 1x MBS-H על צלחות 1x של בארת'. עבור CMF-MBS צלחות, לשפוך 10 מ"ל של CMF-MBS.
   
   
3. כאשר עוברים הופכים בשלב 8.5, להתחיל לנתח את המכסים בעלי חיים צלחת בארת' של 1x. 10-15 explants לכל דגימות הן בדרך כלל מספיק עבור ניסוי.
   
   
4. מעבירים את הכובע explants חיה לצלחת CMF-MBS. דגירה explants עבור 45-60 דקות, עד explants הם ניתק לחלוטין. בהסתה עדין בתוך כל 15 דקות יעזור דיסוציאציה.

הדבקה Cell Assay

1. מתזמן את התאים: לוותר 500ml של 1x MBS-H לחדר הדבקה מוכנים של השלבים בסעיפים לעיל, Assay לשכות הדבקה וציפוי הקאמרית. העברת כובע התאים ניתק חיה מהצלחת CMF-MBS לחדר הדבקה באמצעות P200 עם טיפים צהובים sigmacoated ו הקצוצות.
   
   
2. אופציונלי: אם אפשר, בזהירות למצוץ את בינוני עד כ 2 / 3 ל באמצע הדרך, בלי לחשוף את התאים באוויר. מוסיפים בערך אותה כמות של טרי MBS-H, כדי לוודא בינוני מכיל מספיק Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +.}
   
   
3. לדגור על RT עבור 45-90 דקות. בדוק את התאים מדי פעם כדי לראות אם הם מצרף אל פני השטח התחתון.
   
   
4. עכשיו אתה יכול לקחת את התמונה של התאים תחת מיקרוסקופ.
   
   
5. שים את תא הדבקה על זכוכית שקופית הרשת. יישר באחת הפינות של החדר הידבקות לפינה של השקופית הרשת. הרוזן ולהקליט את מספר התאים המחוברים לרשתות שונות.
   
   
6. יוצקים 1 ליטר של MBS-H בתוך דלי פלסטיק גדול (למשל, פלסטיק וכו '). בעדינות את תא שקופיות הידבקות לתחתית הדלי. סובב אותו על שייקר מסלולית במשך חמש דקות במהירות נמוכה (50 - 60rpm).
   
   
7. שים את תא הידבקות בחזרה בשקופית רשת, יישור מאותה פינה של החדר לפינה אותו להחליק את הרשת, כפי שנעשה בשלב 5 של זה Assay, סעיף Cell הדבקה. ספירת התאים שנותרו מחוברים על הרשת באותו שיש לך לספור לפני הכביסה. חישוב אחוזי התאים נשארים צמודים לאחר הכביסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x MBS-H	בופר			Barth משופר’מצע: מתכון ל-1 ליטר: 5.14 גרם NaCl, 5 מיליגרם KCl, 0.2 גרם NaHCO33 0.2 g MgSO₄4•7H260 מ"ג CaCl22•2H280 מ"ג Ca(NO3)2•4 שעות2O238 גרם HEPES, בצורה חומצית (free-acid). כוון את ה-pH ל-7.4 באמצעות NaOH. בצע עיקור באוטוקלאב.
CMF-MBS	בופר			זהו Ca2+/מגנזיום2+גרסה נטולת MBS-H. מתכון ל-500 מ"ל: 2.57 גרם NaCl, 37.5 מ"ג KCl, 0.1 גרם NaHCO3/תת-מקטע> 1.19 גרם HEPES, חומצה חופשית. כוונו את ה-pH ל-7.4 באמצעות NaOH. עקרו באוטוקלאב.
1% אגרוז/1x Barth’פלטות s				במספר השווה למספר הדגימות
צלוחיות אגרוז 1%/CMF-MBS				במספר השווה למספר הדגימות
כימרה של E-Cadherin/Fc	ריאגנט	Sigma-Aldrich	E-2278	המס 0.1 מג של E-cadherin מוצק ב-100 מיקרוליטר של MBS-H בריכוז 1x המכיל 40% גליצרין, כדי להכין מלאי מאסטר בריכוז 100x (1.0 מג/מ"ל). אחסן אותו ב- –20 °ג. הכין דילול של 1/100 עם MBS-H בריכוז 1x כדי להכין תמיסת עבודה בריכוז 10ug/ml רגע לפני השימוש. נדרשים 200ul מתמיסת עבודה זו לכל דגימה.
פיברונקטין, תמיסה בריכוז 0.1%	ריאגנט	Sigma-Aldrich	F-1141	ניתן להשתמש בתמיסה מוכנה זו כמלאי בריכוז 50x. הכינו דילול של 1/50 עם MBS-H בריכוז 1x, הכינו 20 מ"ל. μתמיסת עבודה בריכוז g/mL ממש לפני השימוש. דרושים 200 μL לדגימות של תמיסה עובדת זו. אני לא ממליץ להשתמש בפיברונקטין (Fibronectin) בצורה מוצקה, מכיוון שקשה להמיסו בריכוז של 0.1% כדי להכין את תמיסת המקור. למרות שעלותה גבוהה יותר, תמיסה מוכנה מראש בריכוז של 0.1% עדיפה כדי להשיג תוצאות עקביות.
4% BSA /MBS-H	בופר			BSA:molecular biology grade fraction V
טיפים צהובים בציפוי Sigmacote	כלי
זכוכית כיסוי מס' 1				40 מ"מ x 24 מ"מ או 60 מ"מ x 24 מ"מ
מבודד סיליקון לאטימה בלחיצה	כלי	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	עומק 2.5 ממ"ק x קוטר 20 ממ"ק
כיסוי זכוכית עם תא NUNC Lab-Tek	כלי	Fisher Scientific	12-565-471	2 באריים/שקופיות
זכוכית עם סריג	כלי			או סריג ספירה (graticule) למספר תאים