אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים לשנות בהרחבה במקומות ורכושם במהלך embryogenesis. שינויים אלה מוסדר על ידי יחסי הגומלין בין התאים לבין סביבתם. עוברים chimeric, אשר מורכב של תאים בעלי רקע גנטי שונה, הם כלי נהדר ללימוד תאים תאים אינטראקציות בתיווך גנים של עניין. השקיפות של דג הזברה העובריים בשלבים התפתחותיים מוקדם היתרי להדמיה ישירה של המורפוגנזה של רקמות ואיברים ברמה התאית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ליצור הרשתיות chimeric והמוח עוברי דג הזברה ולבצע הדמיה חיה של תאים התורם. פרוטוקול מכסה את הכנת מחטים ההשתלה, השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים התורמות GFP שלילי המארחים, ועל בחינה של התנהגות תורם התא תחת מיקרוסקופ confocal לחיות. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההתפתחות העוברית של רקמות ואיברים אחרים דג הזברה. היתרונות של שימוש GFP לתאי התורם התווית הם דנו גם.
פרוטוקול
ביום 1. הכנה
1. הגדר חוצה דגים
הגדר חוצה pairwise של דג הזברה בערב. כדי למנוע הזדווגות אקראית לפני הזמן הרצוי להשתמש חוצצים להפריד את הדג נקבה וזכר את קלטות ההזדווגות. GFP-לבטא דג מהונדס משמשים כמקור בלסטומרים התורם. השורה pt104 מהונדס (Zou et al., 2008), משמש כאן, מבטא GFP בכל מקום בגוף בשליטת היזם EF1. ביטוי של GFP מאפשרת ויזואליזציה של תאים מתורם חי על ידי הדמיה. אחרים הקווים דגים מהונדס המבטאים חלבוני ניאון מתאים ניתן להשתמש לצרכים ספציפיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה blastomere השתלת לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית דג הזברה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים, פשוט על ידי שחרור בלסטומרים התורם למקומות המתאימים את העוברים המארח. תיוג עם מולקולות ה-GFP התשואות רקע נקי יותר עם תיוג פלורסנט צבען מצומדות dextran (הו ו קיין 1990). הסיבה לכך היא פסולת של צבעים dextran מתאי התורם מת נמשך הרבה יותר זמן מאשר ה-GFP, ובכך הסיק עם הדמיה (קטלנו et al. 2007). בנוסף, ה-GFP חיובי התורם תאים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) Core גרנט (5P30EY008098) וקרנות הבאים XW: NIH גרנט R01EY016099 מחקר למניעת עיוורון בפרס פיתוח קריירה. אנו מודים לתרופ קירה לסיוע הדמיה confocal.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
E3 מים ביצה:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl 2
- 0.33 mM MgSO 4
- מתילן כחול 0.1%
מקורות
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
