גרורה ניסויית Assay

סיכום

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

תקציר

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. כדי להבין את המנגנון של גרורות, assay גרורות ניסיוני הוקם באמצעות עכברים immunodeficient. מאמר זה מתאר את ההליכים הכרוכים assay זה, כולל הכנת המדגם, הזרקה תוך ורידית, ותאי culturing של גרורות בריאות. בקצרה, מספר שנקבע מראש של תאים סרטניים אנושיים היו מוכנים

פרוטוקול

1. לדוגמא הכנה

1. לגדל תאים ומחוברות ~ 70% בתקשורת הספציפיים שלהם עם גורמי גדילה או FBS (למשל, DMEM עם FBS 10% MC-1 תאים). לשאוב התקשורת מהצלחת בעדינות לשטוף מספר פעמים עם 1 x PBS (8 g / L של NaCl, 0.2 גר '/ L של KCl, 1.15 גר' / L של Na ₂ HPO ₄ 0.7 H ₂ O, 0.2 גר '/ L של KH ₂ PO _4, pH 7.3).
2. לשאוב PBS ומוסיפים 2 מ"ל של טריפסין 0.05% ב versene (0.014 g / L של פנול אדום 0.2 גרם / L של EDTA-Na ב 1 x PBS, pH 7.2). בעדינות רוק צלחת כדי להקל על ניתוק התא מהצלחת. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. בדרך כלל לוקח 2-5 דקות עבור התאים לנתק.
3. הוספת נפח נרחב של כלי התקשורת המכיל FBS (או מעכב טריפסין סויה) להרוות את פעילות טריפסין לאסוף תאים במבחנה בז 50 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. טען 10μL של השעיה על תא hemacytometer נקי. מספר תאים לכל מ"ל שווה לממוצע # של תאים כל אחד מחמשת ריבועים כפול 10 ^4.
4. צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד (או ~ 200 XG) בצנטריפוגה benchtop במשך 3 דקות.
5. הסר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה. Resuspend תאים בנפח מתאים הפתרון הצפת הנקס מאוזן (HBSS) להגיע הריכוז הסופי של ~ 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
6. תאים סינון דרך מסננת 70 תא פלקון מיקרומטר להוציא אגרגטים תא גדול. הניחו את קצה פיפטה ישירות על גבי המסנן מעל צינור שכותרתו פלקון 5 מ"ל תרבות. מהר להוציא את ההשעיה דרך המסנן לתוך הצינור תרבות.
7. ספירת תאים שוב באמצעות hemacytometer ו לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מ"ל x 10 / ^6. שמור את התאים על הקרח.
8. קבע את יכולת הקיום של התאים. מערבבים כמה תאים עם trypan כחול למדוד את אחוז (כחול) תאים מתים על פני תאים הכולל שימוש hemacytometer. יכולת הקיום של תאים צריך להיות ≥ 90% לפני הזריקה.

2. הזרקה תוך ורידי

1. שנה כפפות. בעדינות לתפוס את הזנב של העכבר immunodeficient (עירום, NOD-SCID, או NSG, המעבדה של ג'קסון) ולמשוך אותו עוצר את העכבר, עם הגב שלה נגד החריץ ואת זנבו מבצבץ מתוך פתיחת קטן בחלק האחורי של עוצר .
2. לאט לאט להחליק את הטבעת פנימה לאורך החריץ ולנעול אותו במקום טבעת פעם תופס את הפה של העכבר. העכבר לא אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אבל צריך הקצב הרגיל של נשימה.
3. מצא את הוורידים זנב גדול. ארבעה כלי הדם הגדולים נמצאים זנב עכבר. כלי דם בצידי הגב ועל הגחון של הזנב הם העורקים. ורידים הם בצידי לרוחב הזנב.
4. צייר יותר מ 200 μL של תאים מוכן לתוך מזרק 1mL. צרף את המחט 30 G1 / 2 אינץ לדחוף החוצה כל בועות אוויר העלולות להתקיים. נפח סופי של תאים המזרק צריך להיות 200 μL (כלומר, 5 X 10 ⁵ תאים בסך הכל).
5. מזריקים תאים לווריד הזנב.
   1. התחלה מהקצה הדיסטלי של הזנב, כך שאם הניסיון הראשון נכשל, אזור הפרוקסימלי יותר של הזנב יכול לשמש לנסות שנייה.
   2. נגבו את הזנב עם אתנול 70%. משוך את הזנב ישר. החזק את קצה הזנב עם האגודל תמיכה הנקודה להזרקה עם האצבע המורה.
   3. הכנס את המחט אל הווריד מזריקים תאים. ודא מחט מזרק מקבילים הווריד במהלך ההזרקה, אחרת יהיה לתקוע את המחט דרך דופן כלי ולהזריק את התאים לתוך הרקמות הסמוכות הזנב.
   4. משוך את המחט לאחר ההזרקה. דם צריך פזרני מאתר ההזרקה אם הזריקה הלך בהצלחה. לחצו על פיסת נקי של מגבת נייר או צמר גפן על הזריקה כדי להקל על קרישת ו למשש את הזנב כלפי מעלה לדחוף את כל המדגם שיורית בווריד למחזור.
   5. שחרר את העכבר מן עוצר ולהחזירו לכלוב. תעדו את תהליך ההזרקה (למשל, בכמה משפטים זה לקח להזריק את התאים כמה הוזרקו תאים) במחברת המעבדה.
   6. קבע את יכולת הקיום של תאים לאחר ההזרקה, כמתואר בסעיף של הכנת המדגם, שלב 9. צעד זה מספק ביטחון כי תאי להישאר בחיים לאורך כל תהליך ההזרקה. בסוף הניסוי זריקה, את הכדאיות של התאים תהיה ירידה, אבל צריך להיות מעל 80%.
   7. (לא חובה) ספין את שאריות התאים ולשטוף את כדורי עם PBS פעם. להקפיא את כדורי ב -80 מעלות עבור ניתוחים בעתיד (למשל, כתמים המערבי לאשר ביטוי גנים או knockdowns).
6. בדרך כלל אחרי חודש או חודשיים, העכברים יהיה גזור ואת המיקומים של גרורות נקבעים גסה. ריאות הוא האתר העיקרי גרורות, שכן הוא מכיל את המיטה נימי הראשון התאים את המפגש לאחרהזן את זרימת הדם.
7. לאחר שטיפה עם PBS, כל האונה של הריאה (או רקמות אחרות המכילות גרורות) הוא ציין תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1). מספר לגילוי גרורות בשני צידי הריאות נספר והמספרים של גרורות הריאה על כל ארבע האונות מתווספים יחד המספר הכולל של גרורות בריאות. ¹ גרורות ריאות מזוהים בקלות רבה יותר אם הריאות המתוקנות לילה פורמלין מאז גרורות יהיה apppear כמו כתמי לבנבן בניגוד לרקמות סמוכות חום כהה ריאות.

3. Culturing תאים גרורות ריאות

1. גרורות הריאה מבודדים עכברים שהוזרק. כל אחד צריך להיות תרבותי בנפרד.
2. גרורות כל טחון עד סוף כובע מחט (סטרילית) על מסננת 70 תא מיקרומטר.
3. שוטפים את מסננת תא עם ה-MLS כמה בינוניים תאים שנאספו שעוברים דרך המסנן בצלחת תרבות.
4. דגירה התאים ב 37 מעלות לפחות ארבעה ימים ללא הפרעה.
5. לשטוף דם או רקמות פסולת על צלחת עם PBS.
6. הוסף בינוני טרי. בהתחלה, הן תאים סרטניים ותאים פיברובלסטים לגדול על הצלחות, אבל בהדרגה, תאים פיברובלסטים ימותו החוצה להיות מוחלף על ידי תאים סרטניים. אם התאים הסרטניים לשאת גנים עמידים סמים, בחר את התאים באמצעות אנטיביוטיקה המתאימה.
7. טוהר של תאים שמקורם נבחנת על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים נגד אדם ספציפי חלבונים. אנו משתמשים נוגדן אנטי אנושי vimentin (NCL-VIM-V9, Novocastra). התאים לנו נגזרת בדרך כלל מכילים מעל 99% של תאים אנושיים, אפילו בהיעדר בחירה סמים. התאים שמקורם החדש יכול להיות מוזרק שוב לעכברים immunodeficient לבחון את היכולות שלהם גרורתי, כפי שתואר לעיל.

4. נציג תוצאות

1. בסוף assay זה, תא גרורתי מאוד לקו בסרטן בדרך כלל מעורר גרורות הריאה רבים (איור 1), ¹ בעוד גרורות הריאה מעט מאוד יבוא קו גרורתי גרוע תאים סרטניים.
2. התאים שמקורם בשיטה זו בדרך כלל להצמיח גרורות יותר לקו ההורים, כאשר הם נבדקים שוב באמצעות assay. ^1-3

באיור 1. נציג תמונות של הריאות העכבר לאחר וריד זריקות זנב של תאים סרטניים. 5 x 10 ⁵ של קו מלנומה גרורתית האדם תאים, התאים SM, ⁴ היו מוזרק לווריד הזנב של עכברים immunodeficient. חודשיים לאחר מכן, הריאות היו מבודדים וגרורות נמצאו מפוזרים בין רקמת הריאה נורמלי.

דיון

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. היא כוללת ארבעה צעדים מרכזיים: ניתוק של תאים סרטניים מ לוקוסים העיקרי שלהם, כניסתם למחזור (intravasation), יציאתם מן המחזור (extravasation), הישרדות וצמיחה באיבר מרוחק. גרורות האדם נחשב תהליך איטי לידי ביטוי לעתים קרובות, לאחר שנים של חביון. כדי ללמוד ההתקדמות שלה מבעוד מועד, assay לעיל ניסיוני מהיר יחסית הוקמה בשנת עכברים immunodeficient. ⁴ מאז הקמתה, נעשה בו שימוש יעיל לבודד תאים שונים עם יכולות גרורתי, לזהות גנים למעלה או ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
פנול אדום	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
טריפן כחול	Invitrogen	15250-061
טריפסין 2.5%	Invitrogen	15090-046
אתנול	Ultrapure	200-CSGP
מבחנת פלקון 50 ml	VWR international	89039-656
מבחנות מיקרוצנטריפוגה	Axygen Scientific	MCT-175-C
מסנן תאים Falcon 70μm	BD Biosciences	352350
מבחנת תרבית פלקון 5ml	VWR international	60818-576
המוציטומטר	Hausser Scientific	15170-208
מזרק 1 ml	BD Biosciences	329650
מחט 30 ½ gauge	BD Biosciences	305106
מכשיר קיבוע לעכברים	Plas Labs Inc.	551-BSRR
מספריים כירורגיים	Fisher Scientific	08-940
פינצטה	Fisher Scientific	08-902
מיקרוסקופ לדיסקציה	Nikon Instruments	SMZ1500
צנטריפוגה לשולחן	Thermo Fisher Scientific, Inc.	75003491