A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Koemans, T. S., et al. Drosophila Courtship Conditioning כמדד ללמידה וזיכרון. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר בדיקת התניה קלאסית שבוחנת למידה וזיכרון בדרוזופילה, הנקראת התניה של חיזור. הבדיקה מבוססת על הפחתת החיזור הגברי לאחר שחווה דחייה על ידי נקבה לא פתוחה מראש. הפרוטוקול לדוגמה מציג הגדרה עבור ההליך שניתן להשתמש בה כדי להעריך זיכרון לטווח קצר וארוך.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTE: בפרוטוקול המתואר להלן, מתואר העתק אחד של איסוף, הדרכה ובדיקה. על מנת לבחון את יכולת השחזור של התוצאות, יש לחזור על שלבים אלה במקביל, במספר ימים, ועם קבוצות נפרדות של זבובים (טבלה 1). הפרוטוקול מבוסס על מחזור חיים של 10 ימים מביצה לבוגר, שהוא נורמלי בעת גידול זבובים בתנאים קבועים של 25 מעלות צלזיוס, 70% לחות ומחזור אור / חושך של 12 שעות. כל ההיבטים של פרוטוקול זה מניחים כי התנאים נשמרים קבועים לאורך כל הבדיקה. הזמנים מצוינים כשעות לפני הדלקת האורות (BLO) או לאחר הדלקת אורות (ALO) באינקובטור, מכיוון שניתן להגדיר זאת בנוחות בהתאם לשעה המועדפת על החוקר. השתמשו בגז_CO2 רק לאיסוף ראשוני של זבובים זכרים תמימים ולאיסוף נקבות שעברו זיווג. פרוטוקול זה להתניה של חיזור מורכב מהשלבים הבאים:

1. הקמת תרבויות איסוף נשיות מוכנות
מראש
2. הקמת תרבויות לאיסוף נבחנים גברים
3. הכנת בלוקים לדיור
4. הקמת בקבוקוני הזדווגות לייצור נקבות קדם-מזווגות סטנדרטיות
5. אוסף נבדקים גברים
6. הדרכה
7. בדיקות
8. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקה

1. ביסוס תרבויות איסוף נשיות טרום זיווגיות

1. הכינו מזון חשמלי. מרתיחים אגר 0.8% (w/v), 8% שמרים (w/v), 2% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 3% (w/v) סוכרוז, 6% (w/v) גלוקוז, 0.05% (w/v) MgSO₄, ו-0.05% (w/v) CaCl₂ במים למשך 15 דקות. אפשר לתמיסה להתקרר ל-70°C לפני הוספת 0.05% (w/v) מתילפרבן (זהירות: רעיל) ו-0.5% (v/v) חומצה פרופיונית (זהירות: רעיל). מערבבים היטב על ידי ערבוב תוך כדי קירור נוסף ל-50°C לקבלת תמיסה הומוגנית.
2. לפני שהמזון מתמצק בטמפרטורת החדר, הוסף ~ 50 מ”ל של powerfood לכל בקבוקון פלסטיק של 175 מ”ל. תנו לאוכל להתקרר עוד יותר. סגור את הבקבוקון באמצעות plug.
   NOTE: Powerfood היא תערובת מזון מיוחדת שפותחה במיוחד לייצור מספר גדול של זבובים, ככל הנראה על ידי גרימת הטלת ביצים. מזון כוח אינו משמש לייצור זבובים זכרים שישמשו לניתוח התנהגות (שלב 2) מכיוון שהתזונה הלא טיפוסית והצפיפות הפוטנציאלית עשויים להשפיע על ההתפתחות.
3. ביום ה-11- (טבלה 1), התחילו 5-20 תרביות בר עם כ-60-100 זבובים (תערובת של זכרים ונקבות) בבקבוקוני מזון כוח; אלה ישמשו בשלב 4 לייצור נקבות מזווגות סטנדרטיות. הוסף נייר סינון לכל בקבוקון כדי להגדיל את השטח שעליו הזחלים יכולים לגור; זה יגדיל את מספר הזבובים שיכולים להיסגר.
4. חזרו מעת לעת על שלבים 1.1-1.3 לאורך הניסוי כדי להשיג מספיק זבובים חדשים כקלט ל”הקמת בקבוקוני הזדווגות לייצור נקבות קדם-מזווגות סטנדרטיות” (שלב 4).

2. הקמת תרבויות לאיסוף נבחנים גברים

1. הכינו מזון רגיל, העשוי מ-0.5% (w/v) אגר, 2.75% שמרים (w/v), 5.2% קמח תירס, 11% (w/v) סוכר, 0.05% (w/v) מתילפרבן, ו-0.5% (v/v) חומצה פרופיונית במים, כמתואר בשלבים 1.1 ו-1.2. סגור את בקבוקוני הפלסטיק בנפח 175 מ”ל באמצעות תקע בקבוקון זבוב.
2. ביום 10- (טבלה 1), הניחו כ-10-20 זכרים עם כ-30-75 נקבות בתולות (טבלת חומרים/ציוד) בכל בקבוקון של 175 מ”ל המכיל מזון רגיל. הוסף נייר סינון כדי להגדיל את שטח הפנים של הגור וכדי למקסם את הפרודוקטיביות.
3. קבע שלושה עד שישה בקבוקונים של 175 מ”ל לכל גנוטיפ כדי להשיג את המספר הנדרש של זכרים נבדקים.
   NOTE: ייתכן שיהיה צורך בבקבוקונים נוספים, בהתאם לפרודוקטיביות של הגנוטיפ הרצוי.

3. הכנת בלוקים לדיור (איור 2A)

1. המיסו כ-50 מ”ל של מזון חשמלי לכל בלוק דיור במיקרוגל, או הכינו אותו טרי.
2. הוסיפו 500 מיקרוליטר של מזון חשמלי לכל באר של בלוק בעל 96 בארות בעלות תחתית שטוחה באמצעות פיפטה מרובת דיספנסרים.
3. תנו למזון להתמצק בטמפרטורת החדר.
4. כסו את הבלוקים בסרט דבק PCR והשתמשו במחט כדי ליצור לפחות 4 חורים לכל באר כדי לספק אוויר צח לזבובים.
5. על מנת שתוכל לפתוח כל באר, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את סרט ההדבקה לאורך בין כל שורה. השאירו את הסרט שלם בקצה אחד של הבלוק.
6. ניתן לאחסן את הבלוקים בטמפרטורה של 4°C למשך עד יומיים.
   NOTE: אפשרו לבלוקים להתאזן מחדש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

4. הקמת בקבוקוני הזדווגות לייצור נקבות קדם-זיווג סטנדרטיות

1. ביום -1, הסר והשלך את כל זבובי הבר הבוגרים מתרבויות איסוף נקבות טרום הזדווגות ב 2-5 שעות BLO.
2. אספו זבובים באמצעות השואף (איור 2B) מהבקבוקונים האלה במרווחים של 2 עד 3 שעות (למשל, ב-30 דקות, 2.5 שעות ו-5 שעות ALO) והניחו אותם בבקבוקון מזון חשמלי חדש בתוספת כמות קטנה של משחת שמרים ונייר סינון.
3. כדי למנוע צפיפות ולקדם אווירת הזדווגות אופטימלית, אין להעביר יותר מ-150-200 זבובים לכל בקבוקון חדש. להבטיח את ההזדווגות של כל הנקבות על ידי מתן לפחות 25% זכרים. ודא שיש מספיק נקבות בבקבוקוני ההזדווגות כדי להתאים לגודל הניסוי.
   NOTE: מכיוון שמדובר בשלב מכריע בפרוטוקול, יש לוודא שרק זבובים טריים ולא זבובים, זחלים או גלמים ישנים מועברים לבקבוקון ההזדווגות החדש.
4. דגרו על “בקבוקוני הזדווגות” אלה במשך ארבעה ימים כדי לאפשר מספיק זמן לכל הנקבות להזדווג.

5. אוסף נבחנים גברים

1. ביום 1 (טבלה 1) בשעה 2-3 שעות BLO, השתמשו ב-CO₂ כדי להסיר את כל הזבובים הבוגרים מבקבוקוני האיסוף של הזכרים (שלב 2), אך תנו לזבובים נוספים להיסגר במהלך השעות הבאות.
2. במהלך 5-6 השעות הבאות, הסירו זבובים חדשים כל 20-30 דקות באמצעות_CO2 והכניסו כל זכר לבאר נפרדת של גוש הדיור (שלב 3) באמצעות השואף (איור 2B).
3. אטמו מחדש את הבאר עם סרט PCR דביק.
   NOTE: זהו שלב מכריע בפרוטוקול. יש לאסוף את הזכרים לעתים קרובות. זכרים שנאספו צריכים להיות מבודדים בבלוק הדיור קרוב לזמן האקלוסיה, כאשר הם מפגינים פיגמנטציה חיוורת ונוכחות של המקוניום בבטן השקופה .
   NOTE: שימוש עדין בשואף מאפשר העברת זבובים; עם זאת, שימוש לא נכון ידגיש את הזבובים, ויגרום לשונות בבדיקה (ראה דיון).
4. המטרה היא לאסוף עד 48 זכרים לכל גנוטיפ. זה מספק עודף קטן למספר המקסימלי של זכרים הדרושים לניתוח של תנאים נאיביים ומאומנים כאחד, ומאפשר אובדן מסוים במהלך שלבי העברה מאוחרים יותר.

6. הדרכה

1. הוציאו את הזבובים מבקבוקון ההזדווגות (שלב 4.2) באמצעות_CO2 והפרידו בין הנקבות המזווגות לבין הזכרים.
2. באמצעות השואב, מוסיפים נקבה אחת מורדמת, טרום זיווג לכל באר בשורה אחת של בלוק דיור חדש.
3. באמצעות השואב וללא הרדמה, מעבירים זכר תמים בודד מבלוק הדיור שהוקם בשלב 5.2 לבאר המכילה נקבה מזווגת. לאחר שהזכר ממוקם בבאר, אטם מחדש מיד עם סרט הדבקה; אל תאפשר לזכר לברוח.
   NOTE: העבר זבובים זכרים מן השואף אל בלוק הדיור על ידי ניצול התנהגותם הטבעית של “גיאוטקסים שליליים”.
4. חזור על שלבים 6.2-6.3 עד שייווצרו מספיק זוגות זכר-נקבה. באופן אידיאלי, להקים 24 זוגות, שתי שורות מלאות של בלוק דיור, לכל גנוטיפ. השאירו את הזכרים התמימים הנותרים בבלוק הדיור המקורי שהוקם בשלב 5.2.
5. השאירו את זוגות הזכרים-נקבות ללא הפרעה במהלך תקופת האימון (טבלה 2, איור 1B).
   NOTE: במהלך תקופה זו, הזכר יחזר ונדחה על ידי הנקבה המזווגת. עבור למידה ו- STM, תקופת ההכשרה היא 1 שעות ועבור LTM, תקופת ההכשרה היא 7-9 שעות.
6. סיימו את האימון (טבלה 2, איור 1B) על-ידי שימוש בשאיפה כדי להפריד בעדינות בין הזכר לנקבה המזווגת; אל תשתמשו בהרדמה. מקם את הזכר המופרד בבלוק דיור חדש.
7. השתמש בשאיפה כדי להעביר את כל הזכרים התמימים בעדינות וללא הרדמה מבלוק הדיור שהוקם בשלב 5.2 לבלוק דיור חדש.
   NOTE: שלב זה הוא אופציונלי עבור STM ולמידה, אך הוא חשוב מאוד עבור LTM מכיוון שהזבובים שוכנים למשך 24 שעות נוספות כדי לבדוק LTM.
8. עבור STM ו-LTM, אפשרו לזכרים לנוח במשך שעה אחת ו~24 שעות, בהתאמה (טבלה 2, איור 1B) לפני הבדיקה (שלב 7).
9. ללמידה, בחנו מיד את הזכרים המאומנים והנאיביים (שלב 7).

7. בדיקות

1. אספו זבובים מבקבוקוני הזדווגות (שלב 4.2) באמצעות_CO2 והפרידו את הנקבות המזווגות מראש מהזכרים.
2. תן לנקבות להתאושש מההרדמה לפחות 1 שעה בבקבוקון המכיל מזון רגיל.
3. הרכיבו את מקליטי הווידאו מראש (איור 2C), כדי להכין את כל הציוד לפני תחילת הבדיקה.
4. התחילו את הבדיקה בהתאם לצירי הזמן השונים ללמידה, STM ו-LTM (טבלה 2, איור 1B). בצע בדיקות מיד לאחר אימון ללמידה, שעה לאחר אימון עבור STM, ו -24 שעות לאחר אימון עבור LTM.
5. באמצעות השואב, העבירו בעדינות זכר בודד מבלוק בית המנוחה או מבלוק בית האימונים אם הלמידה נבחנת (שלב 6.7, מאומן; שלב 6.8, נאיבי) למחצית זירת חיזור עם מחיצה סגורה (איור 2D; ראו קובץ S1 לתוכנית בנייה).
   NOTE: השימוש בהתנהגות הטבעית של “גיאוטקסים שליליים” אמור להספיק כדי להעביר את הזבובים הזכרים מן השואף אל זירת החיזור.
6. הזיזו במהירות אך בעדינות את חור הכניסה לזירה הבאה וחזרו על שלב 7.5 עד שכל 18 הזירות מכילות זכר אחד.
7. באמצעות השואף וללא CO₂, הוסף נקבה אחת מזווגת מראש (שנאספה בשלב 7.2) למחצית השנייה של כל 18 הזירות.
8. הניחו בזהירות את תא החיזור מתחת למצלמה, כשפתח הבארות פונה כלפי מטה (איור 2C).
9. הסר את המחיצה של הזירות כדי לאפשר אינטראקציה ישירה בין הזכרים לנקבות המזווגות.
10. התחל מיד להקליט את ההתנהגות למשך 10 דקות.
    לפחות NOTE: בעת שימוש במערך של שתי מצלמות, ניתן לבצע הקלטה מקבילה של שתי לוחיות חיזור במסגרות זמן חופפות כדי למקסם את היעילות.
11. רוקנו את זירות החיזור באמצעות שואב אבק ידני ואפשרו לתא החיזור להתאוורר לפני שימוש חוזר.
12. חזור על שלב 7.4-7.11 עד להשלמת הבדיקה של כל הגנוטיפים והתנאים (כלומר, נאיביים ומאומנים).

8. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקה

1. חשב את מדד החיזור (CI), המוגדר כאחוז הזמן שהגברים מקיימים במהלך 10 הדקות הראשונות של תקופת הבדיקה, עבור כל זבוב זכר בודד.
   NOTE: ניתן לעשות זאת באופן ידני על-ידי התבוננות בהתנהגות חיזור סטריאוטיפית (איור 1A) או על-ידי שימוש בתוכנת מחשב לכימות אוטומטי של התנהגות חיזור.
   NOTE: מומלץ לנתח 40-60 זכרים לכל מצב במשך שלושה ימים על מנת להשיג כוח סטטיסטי מספיק ולשפוט את עקביות נתוני CI.
2. חישוב מדד הלמידה (LI), המוגדר כאחוז הירידה ב- CI הממוצע של זכרים מאומנים בהשוואה לזכרים תמימים (LI = (CI_naïve – CI_מאומן) / CI_naïve). הערך את ה-LI עבור כל יום בדיקה והשווה אותו ל-LI המצטבר המחושב מכל ימי הבדיקה יחד.
3. צור קובץ נתונים נפרד של כרטיסיות בן שתי עמודות עם “Genotype” ו- “CI” כ- headers.
   NOTE: כותרות אלה תלויות רישיות. שם הגנוטיפ עבור כל CI חייב להיות מורכב מתיאור של הגנוטיפ ואחריו קו תחתון ותנאי האימון (למשל, genotype_N ו-genotype_LTM וכו’, כאשר N = נאיבי ו-LTM = זיכרון לטווח ארוך; ראה קובץ משלים S2 לדוגמה). ביאור זה הוא חיוני, שכן הפונקציה analearn תזהה זבובים מאומנים ותמימים בהתבסס על התווים הנוכחים לאחר הקו התחתון הראשון בטור “גנוטיפ”.
4. השתמש בסקריפט analearn R (קובץ משלים S3) כדי לבצע בדיקת אקראיות כדי לשפוט את המובהקות הסטטיסטית של הבדלים בין ערכי LI מגנוטיפים שונים.
   1. מקור הסקריפט (קובץ משלים S3) לתוך R, המגדיר פונקציה בשם “analearn.”
      NOTE: הגדרת הפונקציה היא: analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. הפעל את הפונקציה על ידי הזנת “analearn()” בשורת הפקודה R ובחירת קובץ הנתונים לניתוח (שהופק בשלב 8.3) דרך החלון הקופץ.
   3. בחר את מוטציית הייחוס, שהיא גנוטיפ הבקרה, על ידי הזנת המספר המתאים והקשה על enter.
      NOTE: לאחר בחירת גנוטיפ הייחוס, הסקריפט לוקח מספר שניות לבצע 10,000 שכפול bootstrap.
   4. שימו לב לטבלת הפלט (טבלה 3), המכילה את הגנוטיפ, מצב הלמידה (כלומר, למידה, STM או LTM), ממוצע CI נאיבי, ממוצע CI מאומן, LI, ההבדל בין LI של הבקרה לעומת תנאי הניסוי (LI dif), הגבול התחתון (LL) והגבול העליון (UL) של רווח בר-סמך של 95% של LI dif, וערך p המציין את ההסתברות שאין הבדל משמעותי.
      NOTE: analearn יאחסן קובץ טקסט פלט בספריה שבה נמצא קובץ הנתונים. עם זאת, טבלת הפלט מופיעה גם במסוף R-Studio. שם ברירת המחדל בנוי בהתבסס על שם קובץ הנתונים שסופק.
   5. ישנם מספר ארגומנטים בפונקציה analearn שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה כדי להתאים את הפרמטרים של bootstrapping.
      NOTE: “nboot” מגדיר את מספר העותקים המשוכפלים של bootstrap ומוגדר כברירת מחדל ל- 10,000. ניתן לשנות ערך זה לכל מספר שלם הגדול מאפס. טבלה 5 מגייסת מספר ארגומנטים שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה. עם זאת, לא מומלץ להשתמש בנתונים המיוצרים עם מספר נמוך של עותקים משוכפלים של bootstrap.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–