פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. הכנת זחלים
- יומיים או יותר לפני תחילת הבדיקה, הציבו צלבים של שילובי הניסוי והבקרה הרצויים (מינימום 20 נקבות ו-10 זכרים כל אחד) בצלחות הטלת ביצים כפי שתוארו על ידי וישאוס ונוסליין-וולהרד, אך באמצעות כוסות פוליפרופילן בנפח 50 מ"ל וצלחות פטרי חד פעמיות בקוטר 6.0 ס"מ המכילות אגר ענבים ונמרחו במשחת שמרים ממש לפני השימוש. יש לשמור את הזבובים בכלי הטלת ביצים בחושך ובטמפרטורת החדר עד לצורך.
- מתכון לאגר ענבים – ערבבו 100 מ"ל תרכיז מיץ ענבים קפוא 100%, 350 מ"ל מים נטולי יואין, 5 מ"ל קרחונים אצטיים ו-13 גרם D. melanogaster agar בכד זכוכית 1L. מחממים במיקרוגל ב-1-2 דקות התפרצויות, תוך ערבוב בין התפרצויות, עד שהאגר מומס כולו. מצננים את התמיסה למשך מספר דקות ולאחר מכן מוסיפים 10 מ"ל של 10% (w/v) של Nipagen (מתיל-p-הידרוקסיבנזואט) באתנול 95%. מערבבים, ואז פיפטה 7 מ"ל לצלחת לתוך כלים חד פעמיים 6.0 ס"מ פטרי, מניחים לג'ל ולייבש בטמפרטורת החדר במשך 3-4 שעות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C בשקיות ניילון.
- מתכון לממרח שמרים – 7 גרם שמרים יבשים, 10 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים עם מרית עד לקבלת מרקם אחיד.
- אוספי ביצים מתוזמנים ליצירת זחלים ניסיוניים וביקורתיים. בעזרת צלחות ענבים חדשות, מרוחות בשמרים, אוספים ביצים בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות בחושך בשעות הבוקר. מוציאים את צלחות האיסוף 4 שעות ומחליפים בצלחות טריות. לדגור על צלחות איסוף 4 שעות לילה ב 25 ° C עד אחר הצהריים של למחרת, כאשר רוב הזחלים יבקעו. אספו את הזחלים הראשונים האלה והשתמשו בהם כדי להגדיר את הניסוי.
2. הגדרת לוחות בדיקה
- הכנת צלחות מבחן. עבור ריצה אחת של הבדיקה, הכינו חמש צלחות בדיקה שכל אחת מהן כוללת 10 זחלי ניסוי וחמש צלחות של 10 זחלי ביקורת. השתמשו בבורר שעם בקוטר 1.5 ס"מ כדי להסיר ליבה מרכזית של אגר מכל צלחת וליצור חור לאוכל. שים משחת שמרים (0.8 - 0.9 גרם) לתוך החור וטפחו בעדינות עם מרית כדי ליצור תלולית הממלאת את החור.
- הכנת צלחת אגר – ערבבו 700 מ"ל מים נטולי יונים, עם 16 גרם ד. מלנוגסטר אגר בכוס זכוכית 2 ליטר וחממו במיקרוגל למשך 5 דקות. מוציאים מהמיקרוגל ומערבבים עם מוט זכוכית כדי להכניס אגר לא מומס לתמיסה. מוסיפים 17.5 מ"ל של 10% (w/v) Nipagen ב-95% אתנול, מערבבים, ואז ממשיכים לחמם במיקרוגל בפרצי 30 שניות ולאחר מכן לערבב, עד שכל האגר מומס לחלוטין. מצננים במשך דקה או שתיים, ואז פיפטה 15 מ"ל aliquots לתוך 10 ס"מ פלסטיק פטרי כלים. מניחים לאגר לג'ל, מכסים את הצלחות במכסים ומניחים להן להתייבש בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות או לילה. יש לאחסן צלחות בשקיות ניילון אטומות בטמפרטורה של 18°C.
NOTE 1: כדי למנוע היווצרות של גבישי Nipagen על פני השטח של לוחות עקב ייבוש עודף, להשתמש צלחות בתוך כמה ימים של הכנה. במידת הצורך, ניתן להמיס גבישים מחדש על ידי הטלת כמה מיקרוליטרים של 95% אלכוהול עליהם.
NOTE 2: לאצוות של אגר יכולות להיות תכונות ג'לינג שונות. צלחות הג'ל היבשות צריכות להיות יציבות למגע ועמידות מספיק כדי שניתן יהיה להסיר עיגול נקי ושלם של אגר בעת שימוש בבורר השעם ליצירת חור המזון (ראה לעיל).
- הגדרת זחלים בצלחות בדיקה. השתמשו בלחץ מכני כדי לעקם את קצה מרית הפלסטיק וטבלו את הקצה במשחת שמרים כדי לספק "דבק" לאיסוף הזחלים. הרימו את הזחלים הראשונים בנפרד והניחו אותם על צלחת האגר קרוב לתלולית המזון. הכינו לפחות חמש צלחות משוכפלות של 10 זחלים עבור גנוטיפים ניסיוניים וביקורתיים. לאחר הסיום, מכסים ומתייגים כל צלחת ומניחים את הצלחות (צד המכסה כלפי מעלה) בחלל חשוך בטמפרטורת החדר (במעבדה שלנו זה 22 מעלות צלזיוס).
3. ניטור לוחיות בדיקה
- בחנו צלחות מדי יום תחת מיקרוסקופ מנתח ורשמו את מספר הזחלים על גבי המזון או על משטח האגר. שימו לב לכל הזחלים המתים או הגוועים הנראים לעין. שימו לב מתי, ואם, מנהור לתוך תת-שכבת האגר נראה כמו הזחלים לנוע לתוך כוכב שלישי. שימו לב לתאריכים שבהם הגלמים מתחילים להיווצר ושימו לב לחריגות בגולם. המשיכו בתצפיות יומיות עד שכל הזחלים מתו או גדלו.
- מוציאים את הגלמים בזהירות מהצלחת בעזרת מחט מתגרה כפופה ומעבירים לצלחת ענבים. אם תרצה, המשך לעקוב אחר הגלמים כדי לקבוע כמה מהם מתקרבים כבוגרים.
