מאמר שיטה

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: מורימוטו, ק. ותמורי, י. אינדוקציה ואבחון גידולים בדרוזופילה אפיתל דיסק דמיוני. J. Vis. Exp. (2017).

בעת צביעת דיסקים דמיוניים של דרוזופילה, לעיתים קרובות מתבצעת דיסקציה גסה בה הדיסקים חשופים אך נשארים מחוברים לגוף. לאחר המוכתמים, הדיסקים המעניינים מבודדים ומורכבים. הפרוטוקול לדוגמה מדגים הליך לדיסקציה והרכבה של דיסק דמיוני בכנף.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. נתיחת זחלים

  1. אספו זחלי כוכב שלישי נודדים בעזרת מקל עץ או מלקחיים קהים, גנוטיפ אותם באמצעות סמנים פלואורסצנטיים מתאימים (למשל, EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי והניחו אותם בכלי דיסקציה עם PBS (מלח חוצץ פוספט).
  2. לשטוף את הזחלים PBS על ידי pipetting עם 2 מ"ל פיפטות העברת פלסטיק.
  3. צובטים את מרכז הזחל במלקחיים אחת וקורעים את הגוף לשניים עם המלקחיים האחרים.
  4. צבטו את וו הפה של החצי הקדמי עם מלקחיים אחת ודחפו את הפה לכיוון הגוף עם המלקחיים האחרים כדי להפוך את הגוף מבפנים החוצה.
  5. הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות רוק או גופי שומן עם מלקחיים.

2. קיבוע וצביעת נוגדנים

  1. מעבירים את החצי הקדמי החתוך של גוף הזחל (כולל דיסקיות כנף דמיוניות) לצינור פלסטיק בנפח 1.5 מ"ל ומקבעים ב-1 מ"ל של תמיסת פיקס (4% פורמלדהיד ב-PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין.
    זהירות: פורמלדהיד רעיל ובעל פוטנציאל מסרטן. יש ללבוש כפפות מגן ובגדים למניעת מגע עם העור.
    NOTE: בחלק זה, כל השלבים מתבצעים על נוטטור בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם כן צוין אחרת.
  2. הסר את פתרון התיקון ובטל. שטפו את הרקמות עם 1 מ"ל PBT (0.3% Triton X-100 ב-PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחת.
  3. הסר את PBT והוסף 1 מ"ל של PBTG (0.2% אלבומין בסרום בקר וסרום עיזים רגיל 5% PBT) לחסימה ואגוז 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
  4. יש להסיר PBTG ולהוסיף תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת כראוי עם PBTG (ראו טבלת חומרים) ונוטאט למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  5. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את הרקמות עם 1 מ"ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחת.
  6. הסר PBT והוסף תמיסת נוגדנים משנית מדוללת כראוי עם PBTG (1:400). אגוזים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (75 °F).
  7. הסר תמיסת נוגדנים משנית ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  8. כדי להכתים F-actin, להסיר PBT ולהוסיף תמיסת Phalloidin מדולל כראוי PBS (1:40). לאחר מכן אגוז במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  9. כדי להכתים את הדנ"א הגרעיני, הסר PBT והוסף תמיסת DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (0.5 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI ב-PBS). ואז nutate 10 min.
    זהירות: DAPI הוא בעל פוטנציאל מסרטן. יש ללבוש כפפות מגן ובגדים למניעת מגע עם העור.
  10. הסר תמיסת DAPI ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
  11. יש לשטוף פעם אחת ב-1 מ"ל PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. הסר PBS והוסף 500 μL של 100% גליצרול כאמצעי להרכבה מראש.

3. הרכבה על שקופיות מיקרוסקופ

  1. הניחו את הרקמות המוכתמות על שקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק בנפח 2 מ"ל.
  2. מעבירים את הרקמות לטיפות של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ אחרת עם מלקחיים.
  3. החזק את קצה הרקמה המנותחת במלקחיים אחת ומשוך את דיסקי אנטנות המוח והעין עם המלקחיים האחרים.
    NOTE: שמור את המוחות המנותחים כדי למקם אותם ליד הדיסקים הדמיוניים של הכנף. המוח משמש כפלטפורמה המונעת מהכיסוי למחוץ את הדיסקים הדמיוניים של הכנף.
  4. כדי לבודד את הכנף דיסקים דמיוניים מחזיקים את קצה הרקמה המנותחת במלקחיים אחת ומגרדים בעדינות את דופן הגוף וקורעים את הדיסקים עם המלקחיים האחרים.
    NOTE: אם קשה למצוא דיסקים דמיוניים כנף, לקלף את קנה הנשימה מהצד האחורי לצד הקדמי. דיסקים דמיוניים כנף נדבקים לקנה הנשימה.
  5. מכסים בעדינות את הדיסקים הדמיוניים בכיסוי ואוטמים בלק; יש לאחסן ב-4°C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנטים
מלח חוצץ פוספט (PBS)וואקו162-19321
טריטוןX-100וואקו168-11805
פורמלדהידוואקו064-00406
אלבומין בסרום בקרסיגמאA7906
סרום עיזים רגילסיגמאG6767
אמצעי הרכבה, Vectashieldמעבדות וקטוריותH-1000
דאפיסיגמאD9542
עכבר-אנטי-Dlg 4F3מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה4F3 אנטי-דיסקים גדולים, RRID:AB_528203מדולל ב-PBTG, 1:40
עכבר-אנטי-MMP1מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה3A6B4, RRID:AB_5797803 מעורב 1:1:1 ומדולל ב-PBTG, 1:40
עכבר-אנטי-MMP1מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה3B8D12, RRID:AB_5797813 מעורב 1:1:1 ומדולל ב-PBTG, 1:40
עכבר-אנטי-MMP1מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה5H7B11, RRID:AB_5797793 מעורב 1:1:1 ומדולל ב-PBTG, 1:40
עכבר-אנטי-אטובוליןמחקרים התפתחותיים בנק היברידיומהAA4.3, RRID:AB_579793מדולל ב-PBTG, 1:100
אלקסה פלואור 546 פלואידיןבדיקות מולקולריותA22283מדולל ב-PBS, 1:40
נוגדן IgG נגד עכבר, Alexa Fluor 546בדיקות מולקולריותA11030מדולל ב-PBTG, 1:400
זני זבובים
SD-Gal4מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#8609משולב מחדש עם UAS-EGFP
upd-Gal4מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#26796משולב מחדש עם UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiמרכז RNAi דרוזופילה וינה#51247
UAS-scrib-RNAiמרכז RNAi דרוזופילה וינה#105412
UAS-RasV12מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#64196
UAS-Yki3SAמרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#28817
hsFLPמרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#6
מעשה>CD2>GAL4 (הפוך את GAL4)מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#4780משולב מחדש עם UAS-EGFP
UAS-EGFPמרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#5428כרומוזום X
UAS-EGFPמרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#6658כרומוזום שלישי
UAS-Dicer2מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#24650כרומוזום שני
UAS-Dicer2מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק#24651כרומוזום שלישי
vkg-GFPמורין ואח' 2001מלכודת חלבונים GFP

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PBS

מאמרים קשורים