פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).
1. פתרונות והכנת חומרים
- הכן את הפתרונות הבאים.
- הכינו תוספת סרום בינונית (SSM): מדיום דרוזופילה של שניידר בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
- הכינו אליציטוטים של אנזים טריפסין 1x (למשל, אנזים TrypLE Express) ואחסנו בטמפרטורת החדר.
- הכינו אליציטוטים של פפאין [50 U/mL] (מאוחסן בטמפרטורה של -20°C והופשר פעם אחת בלבד).
- הכינו 1x מלח חיץ פוספט (PBS, מאוחסן בטמפרטורת החדר).
- הכינו מספר קצוות פיפט מעוגלים להבה לדיסוציאציה פיזית של בלוטות האביזרים.
NOTE: השתמש בטיפים לשמירה נמוכה לטיפול בבלוטות אביזר מכיוון שהן נוטות להיצמד לפלסטיק לא מטופל. תהליך עיגול הלהבה מפחית את פתח הקצה ומחליק את קצוות הקצה. זה מבטיח דיסוציאציה יעילה לאחר עיכול פפטידאז מבלי לגזור את קרום התא.
- חתכו קצה אחד של 200 μL עם להב חד והעבירו אותו בעדינות מעל להבה כדי לעגל את קצהו כך שהפתח יהיה רחב יותר אך חלק לטיפול במהלך שלב 2.7.
- צמצמו את הפתח של קצוות מרובים של 1,000 μL על ידי העברת פתח הקצה ליד להבה למשך פחות משנייה אחת. סובבו מעט את הקצה כדי למנוע המסה מוגזמת או סתימה. מיין את הקצוות העשויים מצר לרחב יותר. ניתן לעשות זאת על ידי תזמון מהירות השאיפה. נסה לנתק מדגם בקנה מידה קטן של AGs כדי לבדוק את היעילות של הטיפים הצרים ביותר.
NOTE: טיפים אלה הם קריטיים עבור תסיסה מכנית. קצוות פיפט איכותיים מעוגלים להבה מאפשרים דיסוציאציה מוחלטת תוך שמירה על כדאיות התא. ככזה, טיפים אלה נשטפים ביסודיות עם מים בסוף ההליך לשימוש חוזר. זה מאפשר דיסוציאציה יומיומית הניתנת לשחזור.
2. דיסקציה של בלוטות האביזר
- שים 20 עד 25 Drosophila זכר בצלחת זכוכית על קרח.
- לנתח 1 זכר ב- SSM. הסר את מערכת הרבייה שלו ונקה את זוג בלוטת העזר מכל שאר הרקמות מלבד צינור השפיכה.
NOTE: הסר אשכים מכיוון שהזרע המשוחרר יכול ליצור גושים ולהפריע לתהליך הדיסוציאציה. הסר את נורת השפיכה, מה שמקשה על הטיפול כאשר היא צפה.
- בעזרת מלקחיים, מעבירים את בלוטות האביזרים לצלחת זכוכית מלאה ב-SSM בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 2.2-2.3 20 פעמים כדי להשיג אצווה של 20 זוגות בלוטות ב- SSM.
NOTE: צעדים אלה יושגו תוך 15 עד 20 דקות. AGs צריך להיראות בריא, ואת התנועות פריסטלטיות של שכבת השריר סביב בלוטות צריך להיות גלוי. ניתן לנטר GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- העבירו את בלוטות האביזרים ל-1x PBS לשטיפה של 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
NOTE: עבור דיסוציאציה טובה יותר, זה הכרחי לשטוף את הבלוטות עם PBS. משך שלב זה, עם זאת, צריך להיות מוגבל כמו התאים מראים סימנים של מתח PBS; תאים משניים מנותקים ב-PBS מתנפחים ומתים במהירות.
- לדלל 20 μL פפאין [50 U/mL] לתוך 180 μL של אנזים טריפסין 1x כדי לקבל את תמיסת הדיסוציאציה (כדי להגדיל או להקטין לשמור 9 μL של אנזים טריפסין ו 1 μL של פפאין עבור כל זכר). בעזרת מלקחיים, להעביר בלוטות אביזר לפתרון זה.
- בודדו את קצה בלוטות האביזר (המכילות תאים משניים) מהחלק הפרוקסימלי. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לצבוט היטב את מרכז האונה הבלוטית ולחתוך עם קצה חד של מלקחיים שנייה. הסר את החלק הפרוקסימלי של בלוטות העזר ואת צינור השפיכה כדי לשפר את הדיסוציאציה ולהפחית את זמן מיון התא.
NOTE: ניתוח החלק הדיסטלי מ -20 זוגות בלוטות ייקח 15 עד 20 דקות ולכן העיכול על ידי פפטידאזות יתחיל בטמפרטורת החדר.
- לאחר שכל קצות הבלוטות נותחו, העבירו אותם לצינור של 1.5 מ"ל באמצעות קצה צינור מיוחד של 200 מיקרוליטר שהוכן בשלב 1.2.1. הוא צריך להיות רחב, מעוגל ורטוב לפני הטיפול בבלוטות.
NOTE: כדי רקמת בלוטת אביזר צינור, טיפים תמיד צריך להיות רטוב מראש עם פתרון מתאים (אנזים טריפסין או SSM, לשמור צינור אחד של כל למטרה זו). יש לשטוף בזהירות טיפים בין הדגימות כדי למנוע זיהום.