דרוזופילה מלנוגסטר דיסקציה שחלתית: טכניקה להכנת רקמות Ex Vivo

תקציר

מקור: Parker, D. J., et al. חקר המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה בשחלות דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את האנטומיה הכללית של שחלה דרוזופילה וכולל שיטה לניתוח שחלות לצורך הדמיה חיה או קבועה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Parker et al., Learning Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. הכנת דרוזופילה (הכלים הדרושים מתוארים באיור 1A)

1. עבור כל אחד מהניסויים המתוארים, לאסוף Drosophila (נשמר בטמפרטורת החדר, או 25 ° C) בתוך 5 ימים של אקלוסיה ומניחים אותם בבקבוקון מלא 5 - 7 מ"ל של מזון Drosophila (ראה טבלה של חומרים), עם לא יותר מ 25 זבובים בכל בקבוקון; לשמור על יחס נקבה:זכר של 2:1.
2. מפזרים כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר את ייצור ביצי דרוזופילה. בצע מניפולציה ניסיונית בתוך 2 - 4 ימים.

2. דיסקציה של שחלות דרוזופילה (הכלים הדרושים מתוארים ב<מחלקה חזקה="xfig">איור 1A)

1. מדיום חיתוך חרקים חם (ראה טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר, 25 מעלות צלזיוס. ממלאים שלוש בארות של צלחת ניתוח זכוכית בת שמונה בארות, עם 200 מיקרוליטר מדיום בכל באר.
2. להרדים Drosophila עם CO₂ על ידי הנחת המחט של אקדח מכה מתחת תקע בקבוקון. הניחו אותם על משטח זבובים. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, ממיינים 5 נקבות ומניחים אותן בבאר הראשונה של צלחת הניתוח. טפל בדרוזופילה אחת בכל פעם בעת ביצוע מיקרוסקופ חי.
3. תוך כדי התבוננות דרך העינית של מיקרוסקופ הדיסקציה, נתקו את בית החזה מהבטן באמצעות שני זוגות מלקחיים. בעזרת המלקחיים, מעבירים בזהירות את הבטן לבאר השנייה של המנה.
4. השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הבטן בקצה האחורי, ודחף לאט את השחלות החוצה (יחד עם תוכן הבטן האחר) עם זוג המלקחיים השני. אם ניסיון זה נכשל, הסר בזהירות את השלד החיצוני של הבטן על ידי החדרת המלקחיים לקצה הקדמי כדי לשחרר את השחלות.
5. בעזרת המלקחיים, החזיקו שחלה בודדת בקצה האחורי האטום (כלומר, הביציות מלאות החלמון, בשלב מאוחר) והעבירו אותה בזהירות לבאר השלישית של התבשיל לצורך הקנטות לעיבודה למיקרוסקופ חי או לקיבוע לביצוע צביעה חיסונית.
6. בזהירות להקניט את נדן המגן סביב השחלות על ידי טאטוא קל של מחט מתגרה מהקצה האחורי לקצה הקדמי של כל שחלה תוך אחיזתה בקצה האחורי עם זוג מלקחיים.
   NOTE: כדי למזער את הנזק במהלך הקנטה, כופפו את קצה המחט והתקרבו לכל שחלה על-ידי הגדלת ההגדלה של המיקרוסקופ (איור 1A). הקנטות צריכות להיות יעילות מספיק כדי לשבור את הנדן, אבל זה צריך להיעשות בזהירות כדי לשמור על שלמות השחלות.

תוצאות

איור 1: תוכנית ניסוי והכנתו. (א) כלים המשמשים בשיטות המתוארות: א. בקבוקון זבוב; ב. מדיום ניתוח חרקים; ג. פרפורמלדהיד; ד. מברשת זבובים; ה. ניתוח תבשיל; ו. כיסוי זכוכית; ז. צינור מיקרופוגה. ח. צלחת עם תחתית זכוכית; I. שקופית זכוכית; J. מיקרופיפטה 1,000-μL; K. 200-μL micropipette; L. 2.5-μL micropipette; M. מתגרה מחט עם קצה כפוף (קצה מוגדל); נ. מלקחיים עבים; א. מלקחיים דקים. (B)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
המדיה של גרייס (מדיום ניתוח חרקים)	פישר סיינטיפיק	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית	50-259-99
פוליליזין	MP Biomedicals	ICN15017625
בקבוקוני טיסה	פישר סיינטיפיק	AS-515
תקעי בקבוקונים מעופפים	פישר סיינטיפיק	AS273
ג'אזמיקס אוכל דרוזופילה (מזון דרוזופילה)	פישר סיינטיפיק	AS153
Azer Scientific EverMark בחר שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	22-026-252
זכוכית כיסוי למיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-542-ב
Mat Tek Corp זכוכית תחתית צלחת Mircrowell	פישר סיינטיפיק	P35G-0-14-C
שמרים יבשים פעילים	פישר סיינטיפיק	ICN10140001
Dumont #5 מלקחיים	טכנולוגיות מדעיות משובחות	11251-20
מחזיק סיכות מצופה ניקל מוריה	טכנולוגיות מדעיות משובחות	26016-12
סיכות Minutien	טכנולוגיות מדעיות משובחות	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	בלומינגטון סטוק סנטר	7194
משטח זבוב	דברים מעופפים	59-118
רובה נשיפה	דברים מעופפים	54-104
מחט רובה נשיפה	Flystuff	54-119
מיקרוסקופ מנתח	קרל זיס	סטמי 2000