בדיקת אי: שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת התנהגות לוקומוטורית של דרוזופילה

תקציר

מקור: Eidhof, I., et al. ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות לוקומוטורית בבדיקת האי דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את בדיקת האי, שיטה התנהגותית המשמשת לחקר תנועת דרוזופילה. הפרוטוקול לדוגמה כולל הגדרה עבור הבדיקה התואמת לניתוח תמונה אוטומטי למחצה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. בניית תיבת הבדיקה של האי

1. הכינו מגש עשוי מחומר חזק, כגון פולי מתיל מתקרילט (PMMA), שיכיל שכבת מים (כלומר אמבטיה). ודא שהחומר אינו לבן.
   NOTE: מידות של 40 x 35 x 2.5 ס"מ³ מומלצות (איור 1A).
2. הכינו קופסה (42 x 38 x 25 ס"מ³) עשויה מחומר חזק ושקוף, כגון PMMA, שתונח סביב האמבטיה כדי למנוע מהזבובים לברוח לחלל המעבדה. מקמו חור (20X30 ס"מ²) בצד הצידי שהוא גדול מספיק כדי שהנסיין יוכל לטפל בקלות בבקבוקונים עם זבובים ולהפיל אותם על האי (איור 1A).
3. הכינו משטח מוגבה בגודל 10X15X2.5 ס"מ^{במידות 3}, עשוי מחומר בלתי חדיר (PMMA או פלסטיק) אטום למים.
   NOTE: פלטפורמה זו נדרשת להיות בעלת משטח לבן אחיד כדי להבטיח ניגודיות טובה לניתוח תמונה. הגודל אינו בהכרח קבוע, אבל הוא צריך להיות גדול מספיק כדי לוודא שכל הזבובים נוחתים תחילה על הרציף ומקבלים הזדמנות ללכת עליו (איור 1A).
4. תקן את הפלטפורמה על ידי הדבקתה לאמבטיה או הנחת משקולות או חפצים כבדים אחרים בתוך קופסת הפלטפורמה כדי למנוע שינויי מיקום של הפלטפורמה במהלך סשן הניסוי / הצילום.

2. דרישות תוכנה והתקנה

1. התקנת תוכנה להקלטת תמונות.
   1. הורד תוכנה להקלטת תמונות כדי להקליט את סדרת התמונות של האי (ראה טבלת חומרים) והתקן את התוכנה במחשב.
      NOTE: תוכנת ההדמיה וההקלטה המתוארת בפרוטוקול זה נתמכת רק על-ידי Windows. חלופה למשתמשים אחרים נוספה לטבלת החומרים.

3. הכנת הזבובים לבדיקה בבדיקת האי

1. איסוף זבובים מבוימים עבור כל תנאי ניסוי תחת הרדמה קרה או פחמן דו חמצני (CO₂), כפי שתואר קודם לכן (על פני תקופה של 1 - 2 ימים).
   1. הכינו לפחות 3 בקבוקונים לדוגמה לכל תנאי ניסוי, שכל אחד מהם מכיל כ-15 זבובים מבוימים. השתמש רק בזבובים עם כנפיים שלמות שהם בגיל ומין דומים.
      NOTE: עבור הניסויים המתוארים כאן, 5 בקבוקונים לדוגמה המכילים 15 זבובים זכרים של הגנוטיפים w^-; Actin-Gal4/+ (בקרה) ^ו-w-; Actin-Gal4/GD11950 (טפו RNAi) נאספו ביום האקלוסיה, התיישנו במשך 4 ימים, ושימשו לביצוע בדיקת האי. RNAi, זני בקרה ודרייבר Actin-gal4 התקבלו ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים).
2. תן לזבובים להתאושש כדי למנוע השפעות מההרדמה (לפחות יום אחד בעת שימוש ב- CO₂) לפני בדיקת הזבובים שנאספו בבדיקת האי בגיל העניין.

4. מערך ניסיוני

הערה: ראה איור 1B.

1. הוסיפו מים קרים עם כמות קטנה של סבון למגש האמבטיה ומקמו את המצע באמצע.
   NOTE: הסבון מקטין את מתח הפנים של המים; זבובים שייגעו במים יטבעו. זה מונע כמויות הולכות וגדלות של זבובים עפים בתיבה במהלך התקדמות הניסוי.
2. הניחו את הקופסה השקופה על גבי המגש והאירו את המשטח מלמעלה באמצעות מנורה.
   NOTE: תאורה של הפלטפורמה נדרשת בעיקר כדי להבטיח ניגודיות וידאו נאותה. נורת LED רגילה של 12-V מתאימה לכך.
3. מקם את מצלמת האינטרנט ישירות מעל הפלטפורמה (מחוץ לקופסה) וחבר אותה למחשב.
4. צור תיקיות חדשות במחשב כדי לאחסן את נתוני הניסוי השונים לפני הניסויים.
   1. עקוב אחר מבנה הדוגמה המתוארת ב- איור 2A כדי ליצור את התיקיות. לדוגמה, אם תכנון הניסוי דורש בדיקה של שני גנוטיפים עם חמישה עותקים משוכפלים כל אחד, תחילה צור תיקייה ראשית המכילה את תאריך הניסוי. בתוך התיקיה הראשית, צור שתי תיקיות משנה (אחת לכל גנוטיפ). בתוך תיקיות הגנוטיפ, צור חמש תיקיות משנה חדשות, אחת לכל replicate.
      NOTE: לניתוח נוסף, חיוני שסדרת התמונות המתאימה לניסויים בודדים תישמר בתיקיות עם שמות ייחודיים.

5. הגדרת הגדרות וידאו בסעיף "לכידת מכשיר" של הממשק

1. פתח את תוכנת הקלטת התמונות ותחת הכרטיסייה "לכידה", לחץ על "תמונות קיטועי זמן..." ובחר את מצלמת האינטרנט המתאימה כ"התקן לכידה".
2. מניחים זבוב מת על האי; התאם את הגדרות הווידאו על ידי לחיצה על התיבה "הגדרות וידאו". גלול בין סרגלי הכלים וכוונן את הבהירות, הניגודיות והצבע באופן שהזבוב המת יופיע שחור על רקע לבן (איור 2B). לאחר השלמת ההתאמות, לחץ על "אישור".

6. הגדרות הקלטה ושמירת וידאו הגדרה בסעיף "קיטועי זמן" של הממשק

1. התאם את ההגדרות ב"הגדרת סרט קיטועי זמן" כדי לשמור את הניסוי כקובץ .avi. לחץ על "עיון...", בחר את הספרייה שבה יאוחסן הסרט, הגדר את שם הסרטון ולחץ על "שמור".
   NOTE: קובץ הווידאו אינו משמש לכימות נתונים; עם זאת, כדאי לקבל מושג כללי על הניסוי.
2. התאם את ההגדרות בסעיף "הגדרת סרט קיטועי זמן".
   1. בתיבת הדחיסה, בחר "קוד Intel IYUV" לדחיסת וידאו ובחר "צלם פריים אחד כל 0.1 שניות", עם "קצב השמעה (תמונות לשנייה):" ב- 10.
   2. שמור את סדרת זמן הניסוי כמסגרות .bmp על ידי לחיצה על "מתקדם..." בחר "צור תמונת .bmp עבור כל פריים שצולם". לחץ על "עיון". בחר את אותה ספרייה בחלון "במהלך לכידת סרט AVI" (כפי שנבחר בשלב 6.1), לחץ על "פתח" ולחץ על "אישור".
      NOTE: שים לב שבמהלך הניסוי, המסגרות מאוחסנות כקבצי .bmp (נדרש לניתוח נתונים). התוכנית קוראת למסגרות בשם "A" ואחריו המספר המתאים לרצף לכידת המסגרות (לדוגמה, "A_number.bmp") (איור 2C). שמור תמיד את התמונות השייכות לניסויים שונים בתיקייה חדשה כדי להבטיח שסדרות תמונות שהוקלטו בעבר לא יוחלפו. שים לב שהתמונות אינן נשמרות באופן אוטומטי באותה תיקיה כמו קובץ הווידאו, אלא אם כן תיקיה זו נבחרה תחת "עיון..." בעת לחיצה על התיבה "מתקדם".

7. בדיקת האי ואיסוף נתונים

1. לחץ על לחצן התחל בממשק התמונה בהילוך מהיר של תוכנת הקלטת התמונות כדי להתחיל את ההקלטה.
2. הקש על בקבוקון הניסוי המכיל זבובים (שלב 3) 2-3 פעמים כדי לוודא שהזבובים נמצאים בתחתית הבקבוקון. הסר במהירות את תקע הבקבוקון, ובתנועה נמרצת הקש על הבקבוקון שעל הרציף כך שכל הזבובים ייפלו על הרציף באותו זמן (איור 1C).
3. לאחר כ -30 שניות, לחץ על כפתור "עצור" כדי להפסיק את ההקלטה.
   NOTE: אם כל הזבובים נעלמים מהפלטפורמה, ניתן לעצור את ההקלטה מוקדם יותר.
4. הסר את הזבובים שנותרו במשך 30 שניות על הפלטפורמה ביד לאחר הפסקת הקלטת התמונה.
5. לפני שתמשיך להקליט את הניסוי הבא, שנה את ספריית היעד עבור קבצי .bmp והסרטים (ראה סעיף 6).

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה המתאר את הדרישות, הליך הניסוי והניתוח של בדיקת האי. (א) ציוד בדיקת אי. (B) מערך ניסיוני לניסוי האי. (ג) בדיקת אי. (D) עיבוד נתוני בדיקת האי במאקרו "Drosophila Island Assay". המאקרו "Drosophila Island Assay" מורכב מ-3 תתי-מאקרו: 1) ליצור מחסנית והשלכה, 2) להגדיר פלטפורמה, ו-3) ניתוח. (ה) עיבוד והערכה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוקוני דרוזופילה בגודל 25 x 95 מ"מ	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD מצלמת אינטרנט	לוג'יטק	-	כל מצלמת אינטרנט עם חיבור USB מתאימה.
מעמד כדי להחזיק מצלמת אינטרנט	-	-	-
מנורה	-	-	נורות LED 12 V מתאימות
כרית דפיקות	-	-	כל משטח עכבר עובד
תיבת Island Assay	-	-	מידות 40x35x2.5 ס"מ. חור 20x30 ס"מ. שקוף.
אי אסאי אמבטיה	-	-	מידות 42x38x25 ס"מ. לא לבן.
אי/פלטפורמה	-	-	מידות 42x38x25 ס"מ. לבן אחיד.
סבון	-	-	חומר ניקוי סטנדרטי לשטיפת כלים מתאים.
מחשב	-	-	סקריפטים פועלים הן ב- Windows והן ב- Mac
תוכנה להקלטת תמונות: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi תואם רק ל- Windows ותואר לאורך כל כתב היד. ניתן להוריד אותו מ: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (גרסה 5.0)
תוכנת הקלטת תמונות: WebcamCapture	-	-	תוסף פיג'י/ImageJ שניתן להשתמש בו במק חלופי להנדיאבי להקלטות תמונות וניתן להוריד אותו מ: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ בעת שימוש בשיטה זו, על המשתמש להשתמש באותה הגדרת תיקייה והגדרות הקלטת תמונות המצוינות בכתב יד זה, למעט העובדה שעבור כל שכפול ניסיוני, יש לייצא את אוסף התמונות שנלכד Stack.tiff לתיקיית השכפול הניסיוני המתאימה. בעת הפעלת המאקרו "Drosophila Island Assay" על נתונים אלה, לא אמור להופיע טקסט בהגדרה "מזהה מסגרת ראשונה".