פרוטוקול תוחלת חיים עבור Drosophila melanogaster: יצירת עקומות הישרדות לזיהוי הבדלים בתוחלת החיים של זבובים

תקציר

מקור: Bovier, T. F., et al. שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית במלנוגסטר דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2019).

מדענים משתמשים בפרוטוקול תוחלת החיים של דרוזופילה כדי למדוד כיצד תנאי ניסוי שונים משפיעים על תוחלת החיים של הזבובים וליצור עקומות הישרדות בתהליך כדי לכמת את תוצאות הניסוי. פרוטוקול הדגימה כולל את הבדיקה המיושמת כדי לחקור את ההשפעות על אריכות ימים מחשיפה לריכוזים משתנים של כימיקלים משבשים אנדוקריניים, או EDCs, כגון 17-α-ethinylestradiol (EE2).

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנת מזון

1. לתחזוקת המלאי ולגדילת הזחלים, השתמשו במדיום קמח תירס המכיל 3% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 9% קמח תירס מבושל מראש, 0.4% אגר, לאחר מכן נקרא מדיום קמח תירס (CM).
   1. שים 30 גרם של שמרים לתוך 100 מ"ל של מי ברז, להביא אותו לרתיחה ולתת לו להרתיח במשך 15 דקות.
   2. בנפרד, מערבבים היטב 90 גרם קמח תירס מבושל מראש, 100 גרם סוכר, ו 4 גרם אגר לתוך 900 מ"ל של מי ברז.
   3. מביאים את הפתרון לרתיחה, מנמיכים את האש ומבשלים במשך 5 דקות תוך ערבוב רציף.
   4. לאחר 5 דקות, מוסיפים את תמיסת השמרים החמים ומבשלים על אש קטנה עוד 15 דקות.
   5. כבו את מקור החום ואפשרו לתמיסה להתקרר לכ-60 מעלות צלזיוס.
   6. מוסיפים 5 מ"ל/ליטר של 10% מתיל 4-הידרוקסיבנזואט באתנול, מערבבים היטב ומניחים לזה לשבת במשך 10 דקות.
      NOTE: היזהר עם כמות מתיל 4-hydroxybenzoate, בהתחשב בכך ריכוז גבוה של קוטל פטריות יכול להיות קטלני עבור הזחלים.
   7. יש לחלק את התווך לבקבוקונים/בקבוקים: 8 מ"ל לכל בקבוקון זבוב (25 מ"מ x 95 מ"מ), 3 מ"ל לכל בקבוקון זבוב (22 מ"מ x 63 מ"מ) ו-60 מ"ל לכל בקבוק זבוב (250 מ"ל).
   8. כסו את הבקבוקונים בבד גבינה ואפשרו להם להתייבש בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות לפני האחסון.
   9. כיול העקביות וההידרציה הנכונות של CM על ידי שינוי כמות האגר בשימוש ו / או זמני הקירור/ייבוש.
      הערה: בקבוקונים מנותקים, ארוזים ועטופים יציבים במשך כ-15 ימים ב-4°C.
2. למבוגרים עם דרוזופילה יש להשתמש במדיום המכיל 10% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 2% אגר, ולאחר מכן נקרא מדיום בוגר (AM).
   1. מערבבים 10 גרם אבקת שמרים, 10 גרם סוכרוז, 2 גרם אגר לתוך 100 מ"ל מים מזוקקים.
   2. מביאים את התערובת לרתיחה פעמיים, במרווח של 3 דקות, או עד להמסת האגר, באמצעות מיקרוגל.
   3. לאחר שהתמיסה מתקררת ל-60°C, הוסיפו 5 מ"ל/ליטר של 10% מתיל 4-הידרוקסיבנזואט באתנול, ערבבו היטב והניפקו בבקבוקונים (10 מ"ל לבקבוקון).
   4. כסו בקבוקונים בבד גבינה ותנו להם להתייבש ב-RT למשך 24 שעות לפני האחסון.
      הערה: בקבוקונים מנותקים, ארוזים ועטופים יציבים במשך כ-15 ימים ב-4°C.

2. דרוזופילה מינון EDC

1. הכן פתרון מלאי מתאים המסת ה- EDC שנבחר בממס המתאים. עבור EE2 (משקל מולקולרי 296.403), יש להמיס 1.48 גרם ב-10 מ"ל של אתנול 100% כדי ליצור תמיסת מלאי של 0.5 מ' ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
   זהירות: EDCs נחשבים למזהמים סביבתיים ויש לנקוט אמצעי זהירות בטיפול בהם.
2. דללו את תמיסת מלאי EE2 באתנול 10% במים (v/v) על מנת לקבל תמיסה של 100 מילימטר. בצע את הדילולים הבאים (0.1 mM, 0.5 mM ו- 1 mM) במזון CM, החל מהריכוז הנמוך ביותר והשתמש באותו ריכוז סופי של ממס עבור כל קבוצת טיפול. עבור בקבוקוני הבקרה להשתמש באותו נפח של הממס לבד.
   הערה: מומלץ לשמור על ריכוז סופי של הממס נמוך ככל האפשר, תוך התחשבות בכך שהריכוז הסופי של אתנול לא יעלה על 2% במזון זבובים.
3. מוסיפים את התמיסה המכילה את הדילול הנכון של ה-EDC שנבחר למזון המבוסס על קמח תירס לפני המיצוק, מערבבים היטב עם מעבד מזון, מחלקים 10 מ"ל לבקבוקונים, מכסים בגזה כותנה ומניחים להתייבש ב-RT למשך 16 שעות לפני השימוש.
   NOTE: השתמש במדיום זה מיד לאחר הכנתו.
4. לגידול בוגרים, הכינו תמיסות EE2 שונות (10 מילימול, 50 מילימטר ו-100 מילימול, בהתאמה) באתנול 10% במים (v/v) ובשכבה 100 מיקרוליטר של כל אחת מהן על פני השטח של ה-AM, על מנת להשיג את הריכוז הרצוי של ה-EE2 (0.1 מילימול, 0.5 מילימטר ו-1 מילימול). עבור הבקרה להשתמש באותו נפח של הממס לבד.
   NOTE: לחלופין, הוסף את התמיסה המכילה את הדילול הימני של ה- EDC שנבחר לכמות קטנה של AM בצינור חרוטי של 50 מ"ל, מערבל ביסודיות וריבוד 1 מ"ל ממנו על פני השטח של בקבוקוני AM.
   1. מכסים בקבוקונים בגזה כותנה, מאפשרים ייבוש ב-RT למשך 12-16 שעות תחת תסיסה עדינה ומשתמשים בהם מיד.
      הערה: יש להתאים את תהליך הייבוש באופן ניסיוני מכיוון שהוא תלוי בלחות הסביבה.

3. גידול זבובים

1. השתמש בזן איזוגני חזק, כגון אורגון R, המתוחזק על ידי מספר דורות במעבדה.
2. יש לשמור את הזבובים באינקובטור לח ומבוקר טמפרטורה, עם אור טבעי של 12 שעות: 12 שעות פוטופריוד כהה ב-25 מעלות צלזיוס בבקבוקונים המכילים מזון CM.
3. בכל בדיקה, השתמש בבקבוקונים ב- RT.

4. פרוטוקול תוחלת חיים

1. הגדר 20 בקבוקונים של זבובים עם 8 נקבות ו -4 זכרים ובית ב 25 ° C בס"מ (10 מ"ל כל אחד).
2. לאחר 4 ימים להשליך זבובים ולהחזיר בקבוקונים לאינקובטור.
   NOTE: ניתן להשתמש בזבובים אלה כדי להתחיל מחדש כדי להשיג קבוצות אחרות של הזבובים המסונכרנות לגיל.
3. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום 9, הוציאו את כל הזבובים החדשים מהבקבוקונים והחזירו בקבוקונים לאינקובטור.
   הערה: כמה מבוגרים צריכים להתחיל לסגור כבר ביום התשיעי; השלכת זבובים אלה מאפשרת לאסוף מספר מרבי של זבובים מסונכרנים, הימנעות בחירה רשלנית של הופעה מוקדמת.
4. 16-24 שעות לאחר מכן, העבירו את הזבובים הבוגרים (בני יום אחד) משני המינים לארבע קבוצות של בקבוקי 250 מ"ל המכילים מזון AM בתוספת שלושה ריכוזי EDC שונים ואחד עם הממס בלבד. במידת הצורך, אספו אצווה נוספת למחרת.
5. שמור על זבובים ב 25 ° C במשך 2-3 ימים כדי לאפשר להם להזדווג.
   הערה: יום המעבר לבקבוקוני מזון AM מתאים ליום הראשון לבגרות.
6. לאחר יומיים-שלושה, מיין כל קבוצה של זבובים לפי מין לשתי קבוצות תחת הרדמה קלה של CO₂. חלקו באופן אקראי כל מין לחמישה בקבוקונים לכל טיפול בצפיפות של 20 פרטים לכל בקבוקון, עד שיהיו שלושה העתקים של 5 בקבוקונים מקבילים לכל מין לכל טיפול.
   NOTE: עבוד עם קבוצות קטנות של זבובים על מנת למנוע בעיות בריאותיות ארוכות טווח עקב זמן חשיפה ארוך ל-_CO2.
7. הכינו גיליון אלקטרוני של תוחלת חיים שבו מספר הזבובים המתים מופחת ממספר הזבובים ששרדו להעברה הקודמת, באופן שיקבל באופן אוטומטי את מספר הניצולים בכל העברה.
8. העבר זבובים לבקבוקונים חדשים המכילים את המזון המתאים כל 3 ימים בו זמנית ובדוק אם יש מוות.
   NOTE: ההעברה חייבת להתבצע ללא הרדמה שעלולה להשפיע לרעה לטווח ארוך על תוחלת החיים של הזבוב.
   1. בכל העברה, רשום את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים.
      הערה: מספר הזבובים ששרדו מחושב אוטומטית בגיליון האלקטרוני, אך מומלץ לבדוק אותו חזותית. זבובים שבטעות גם בורחים או מתים במהלך ההעברה לא צריכים להיחשב. היזהר לא לספור פעמיים זבובים מתים שנשאו לבקבוקון החדש המדווח על הערה זו בגיליון האלקטרוני.
   2. חזור על שלבים 4.8 ו- 4.8.1 עד שכל הזבובים ימותו.
9. עבור כל קבוצת טיפול, צרו עקומת הישרדות כפי שמוצג באיור 1, כדי להציג את הסתברות ההישרדות של זבוב בכל זמן נתון.
10. בצע שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצת טיפול בזבובים, באמצעות שימוש ב-100 זבובים חדשים שנסגרו עבור כל ניסוי.
11. הכינו טבלה שבה תוכלו לדווח על תוחלת החיים הממוצעת (ממוצע ימי ההישרדות של כל הזבובים לכל קבוצה), על מחצית זמן המוות (פרק הזמן בימים הנדרש כדי להגיע ל-50% תמותה) ועל תוחלת החיים המרבית (כמות הימים המרבית הדרושה כדי להגיע ל-90% תמותה).
12. חישוב ההבדלים באחוזים בין כל קבוצת טיפול ביחס לקבוצת הביקורת.
13. לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות בין קבוצות הטיפול השונות.

תוצאות

איור 1: עקומות תוחלת חיים. משמאל, מדווחת טבלה מייצגת שבה נרשם מספר הזבובים המתים כל 3 ימים, הן עבור קבוצת הטיפול (בינוני + EDC [0.05 mM EE2]) והן עבור קבוצת הביקורת (בינונית + ממס), לאורך כל תקופת הניסוי. תוחלת החיים הממוצעת של כל קבוצה חושבה באמצעות סכום המטריצה. מוצר; הקבוצה שטופלה קיצרה את תוחלת החיים הממוצעת בהשוואה לקבוצת הביקורת. מימין, עקומת הישרדות טיפוסית מוצגת של זבובים זכרים הניזונים בתווך המכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
17α-אתינילאסטרדיול	סיגמא	E4876-1G
אגר למדיום דרוזופילה	ביוסיגמה	789148
קמח תירס	קא' ביאנקה
בקבוקוני דרוזופילה	ביוסיגמה	789008	25 מ"מ x 95 מ"מ
בקבוקוני דרוזופילה	ביוסיגמה	789009	29 מ"מ x 95 מ"מ
בקבוקוני דרוזופילה	קלטק	187	22 מ"מ x 63 מ"מ
אתנול	פלוקה	2860
בקבוק זכוכית			250 מ"ל בקבוקים
בקבוקוני זכוכית	מיקרוטק	רח' 10024	צינור תחתון שטוח 100 x 24
שמרים להצלחה מיידית	אסק"א		אבקת שמרים
מתיל4-הידרוקסיבנזואט	סיגמא	H5501
סטריאומיקרוסקופ עם נורות LED	לייקה		S4E
סוכרוז	הימדיה	MB025
בלנדר מוט פימי	אריאטה		מעבד מזון