$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. דרישות לפני עיבוד תמונה
- בצע הכנת ספר פתוח דרוזופילה של זחלים נודדים שלישיים (L3), כפי שתואר קודם לכן.
- Co-immunolabel Drosophila NMJ terminals באמצעות שילוב של שני סמנים: Dlg-1 או Hrp יחד עם Brp לניתוח עם "Drosophila NMJ Morphometrics", ו- Syt או Csp יחד עם Brp לניתוח עם "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTE: ניתן לשלב נוגדנים מאותו זן על ידי תיוג מראש עם ערכת הצמדת נוגדנים כגון ערכות התיוג Zenon Alexa.
- תמונה NMJ הדקים באמצעות מיקרוסקופ לבחירה, למשל, פלואורסצנטיות (עם או בלי ApoTome) או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- רכוש ערימת תמונות דו-ערוצית של מסוף NMJ.
- התאם את הגדרות המיקרוסקופ באופן שבו ערוץ 1 ירכוש את מסוף NMJ המסומן עם Dlg-1 (או Hrp, Syt, Csp) ואת ערוץ 2 את מסוף NMJ המסומן עם Brp.
- לחלופין, נתח תמונות חד-ערוציות (של סינפסות המסומנות בנוגדן יחיד) עם פקודות המאקרו. תמונה NMJs immunolabeled ייחודי עם Dlg-1 או Hrp לניתוח עם "Drosophila NMJ Morphometrics", או Syt או Csp עבור "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTE: לא ניתן לנתח סינפסות immunostained עם רק anti-Brp.
- ייצא את התמונות המתקבלות כקובצי .tiff בודדים. הפוך את סדר הערוצים לפני הפעלת פקודות המאקרו אם לא נרכש כפי שצוין.
2. דרישות תוכנה והתקנה
- הורד את פקודות המאקרו: "Drosophila NMJ Morphometrics" ו- "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" מהאתר הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- העבר את הסמן לתיקייה "עדכון פקודות מאקרו 1" ולחץ על האפשרות המופיעה "תצוגה". תופיע רשימה עם התוכן של תיקיה זו. התיקיה מכילה את פקודות המאקרו "Drosophila NMJ Morphometrics" ו- "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
NOTE: שתי פקודות המאקרו תואמות לגירסאות פיג'י 1.4, המסופקות גם הן באותה תיקיה. ייתכן שפקודות המאקרו לא יפעלו בגירסאות האחרונות. אנא השתמש בגרסה 1.4 המצורפת. אין בעיה להפעיל גרסה זו, אפילו במחשבים עם גרסה פיג'י עדכנית יותר זמינה.
- לחץ על "הורד הכל". תוכן התיקיה יורד למחשב כקובץ .zip. חלץ את הקובץ שהורדת.
- העתק את הקבצים Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm ו- Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm לספריה Fiji.app/plugins/. בעת הפעלה מחדש של התוכנית, פקודות המאקרו יופיעו בתחתית התפריט הנפתח תוספים.
3. הפעל מאקרו משנה "המר לערימה" כדי ליצור הקרנות Z וערימות יתר של תמונות NMJ
- הפעל את הממשק הגרפי על ידי בחירת תוספים בסרגל הכלים ובחר "Drosophila NMJ Morphometrics" בתפריט הנפתח.
- הגדר את ההגדרה "מחרוזת קובץ ייחודית" בממשק הגרפי של המאקרו.
NOTE: תוכנת המיקרוסקופ משתמשת בחתימת זיהוי כדי לארגן מישורים וערוצים בעת אחסון ערימות כקבצי .tiff בודדים. הגדרת מחרוזת הקבצים הייחודית שהוזנה צריכה לציין את החתימה שהוקצתה על-ידי התוכנה למישור הראשון של הערוץ הראשון (חשוב: יש לציין את המישור הנמוך ביותר ואת מספר הערוץ).
- בחר רק את המאקרו משנה "המר לערימה" ולחץ על "אישור" ובחר את התיקיה שבה התמונות ממוקמות. אם נבחרה ספרייה ראשית עם מספר תיקיות משנה, יעובדו כל קבצי .tiff בודדים בספרייה הראשית ובתיקיית המשנה התואמים לקריטריוני מחרוזת הקבצים הייחודיים.
- אם ערימת z מכילה ערוץ אחד בלבד, בחר בתיבה "ערוץ 1 בלבד".
- שים לב שיופיעו שני קבצים חדשים לכל תמונת NMJ, המכונים כברירת מחדל stack_image_name ו- flatstack_image_name. אחסן רק ערימה וערימה שטוחה אלה לצורך ניתוח נוסף. ניתן למחוק את סדרת הקבצים .tiff בשלב זה, תוך מזעור קיבולת האחסון הנדרשת והימנעות ממקורות שגיאה פוטנציאליים.
4. הפעל מאקרו משנה "הגדרת החזר השקעה" כדי להגדיר את מסוף העניין של NMJ
- התחל את הממשק הגרפי של "Drosophila NMJ Morphometrics".
- בחר רק את תיבת הסימון "הגדר החזר השקעה" ולחץ על "אישור" ובחר את הספרייה הראשית שבה מאוחסנות התמונות שכותרתן flatstack_name ולחץ על "בחר". מאקרו המשנה "Define ROI" מחפש באופן אוטומטי בכל תיקיות המשנה בספרייה הראשית שנבחרה.
- עם פתיחת ההקרנה הראשונה, בחר בכלי "בחירות חופשיות" בסרגל הכלים.
- באמצעות העכבר לצייר בחירה המכילה באופן בלעדי את מסוף NMJ המלא של עניין ולחץ על "אישור" בחלון "הגדר מסוף". המאקרו ימשיך עם התחזית הבאה.
- הגדר את החזר ההשקעה הבא וחזור על הפעולה עד להגדרת כל החזר ההשקעה. קובץ התמונה ROI, בשם "roi_image_name", יאוחסן באותה ספרייה כמו תמונות הערימה וההקרנה שנוצרו בעבר עבור כל אחת מהתמונות המעובדות. הפלט של תת-מאקרו זה הוא תמונה בינארית של החזר ההשקעה בלבן על רקע שחור.
5. הפעל תת-מאקרו "נתח" כדי לכמת תכונות מסוף NMJ
- עבור אל סרגל הכלים, בחר "תוספים" והשתמש:
"דרוזופילה_NMJ_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות עם אנטי-Dlg-1 או אנטי-HRP (ערוץ 1) יחד עם אנטי-Brp (ערוץ 2), או "דרוזופילה_NMJ_Bouton_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות עם אנטי-Syt או אנטי-CSP (ערוץ 1) יחד עם Brp (ערוץ 2).
- כאשר יש לנתח ערימות תמונות של ערוץ אחד (הערוץ המבני Dlg-1 או HRP עבור "Drosophila_NMJ_Morphometrics", או Syt או Csp עבור "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), בחר בתיבה "ערוץ 1 בלבד".
- התאימו את קנה המידה המתאים לתמונות שיש לנתח.
- אם פיקסל אחד בתמונה מתאים ל- 2.5 מיקרומטר, ציין קנה מידה-פיקסלים = 1, מרחק קנה מידה במיקרומטר = 2.5. במקרה ששתי ההגדרות נותרות על 0, אזור NMJ, ההיקף, האורך ואורך הענף הארוך ביותר יבואו לידי ביטוי במספר פיקסלים.
- במידת הצורך, התאם את הגדרות ברירת המחדל של ניתוח המאקרו. בצע התאמות רק אם המאקרו המשנה "נתח" הופעל בעבר עם תוצאות לא משביעות רצון (ראה סוף סעיף זה, וסעיף 6 לקבלת הוראות כיצד למטב את ההגדרות).
- בחר את תיבות הסימון "נתח" ו "המתנה" ולחץ על "אישור".
- בחר בתיבת הסימון "המתנה" בעת הפעלת מאקרו המשנה "נתח" בתמונות 2 ערוצים. אחרת, שגיאות בספירת אזורים פעילים עלולות להתרחש עקב קיבולות מחשב מוגבלות.
- כאשר נפתח חלון חדש "בחר ספרייה", בחר את הספרייה שבה ממוקמות התמונות ולחץ על "בחר". המאקרו ינתח את כל התמונות המאוחסנות בספרייה הראשית, ואם רלוונטי, את התיקיות הבאות (באמצעות שלושת הקבצים מהפעלת פקודות המאקרו הקודמות: stack_image_name, flatstack_image_name ו- roi_image_name). המאקרו מעבד כל תמונה בנפרד וברצף. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות לכל אוסף תמונות (בהתאם לקיבולת המחשב).
- לאחר הפעלת המאקרו, שים לב שקובץ תמונה חדש בשם res_image_name עבור כל סינפסה מנותחת המאוחסנת ייווצר בתיקיית ההורים. המדידות הכמותיות יישמרו כקובץ "results.txt".
- בדוק את כל תמונות התוצאה כדי לזהות ולא לכלול תמונות עם שגיאות סגמנטציה. שגיאות סגמנטציה אפשריות מתוארות בטבלה 1, יחד עם עצות כיצד להתאים הגדרות כדי לעקוף שגיאות אלה. תמונות תוצאה עם שגיאות פילוח כאלה מובאות כדוגמאות ב- איור 1.
NOTE: בעת הפעלת המאקרו עם הגדרות ברירת המחדל שנצפו בממשק המשתמש, היה דיוק של כ- 95% כאשר הערכת המאקרו הושוותה להערכה ידנית.
6. התאם את הגדרות המאקרו לתמונות
- כאשר יותר מ-5% מהתמונות מציגות שגיאות סגמנטציה, חקור את האלגוריתמים השונים כדי להגדיר/לבחור את הגדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות.
- התאם את ערך רדיוס כדור הגלגול
NOTE: פונקציית רדיוס הכדור המתגלגל מפחיתה את רקע התמונה. לפונקציה זו חשיבות מכרעת בעבודה עם תמונות שנרכשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי ו/או כאשר לתמונות יש רעשי רקע גבוהים. החיסור של הרקע יסייע לשלבי הסף האוטומטיים של המאקרו לייצר פילוח הולם של מסופי NMJ.
- בחר שלוש תמונות NMJ stack_image_name שנוצרו על-ידי תת-המאקרו "המר לערימה". בחרו תמונות המייצגות את ערכת נתוני התמונה.
- בסרגל הכלים, בחר תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים. ייווצרו שני אוספי תמונות, האחד מייצג את ערוץ 1 והשני ערוץ 2, בהתאמה וישמרו אותם.
- פתח את מחסנית התמונות השייכת לערוץ 1 פתוח, המתאים ל- Dlg-1, Hrp, Syt או Csp immunolabeling.
- הפעל את המסנן "החסר רקע" על ידי בחירה באפשרות "תהליך" בסרגל הכלים ואחריו "החסר רקע..." בתפריט הנפתח.
- לחץ על תיבת הסימון של התצוגה המקדימה בחלון הקופץ והתאם את רדיוס הכדור המתגלגל לערך המתאים ביותר לתמונות. יש להתאים את ההגדרה "רדיוס כדור מתגלגל" לערכים המגבירים את הניגודיות בין סינפסה לרקע (ראו איור 2A').
- ראו לדוגמה איור 2. בלוח A, חלקים מהסינפסה מציגים את אותן רמות אפורות כמו הרקע, ואילו בלוח איור 2 בלוח A' "רדיוס כדור מתגלגל" של 500 יוצר ניגודיות חזקה בין הסינפסה לרקע.
- יצירת הקרנת z על-ידי בחירה בסרגל הכלים תמונה | ערימה | הקרנת Z, בחרו סוג הקרנה = עוצמה מרבית ושמרו את התמונה שהתקבלה. כאשר מוגדר הערך המתאים לרדיוס הכדור המתגלגל, הפעל את האלגוריתם "הפחת רקע" בשאר התמונות המייצגות בעלות אותו ערך רדיוס כדור מתגלגל. צור את תחזיות Z ושמור אותן (בכל ספרייה).
NOTE: ערך רדיוס הכדור המתגלגל לתמונות של 8 סיביות או RGB צריך להיות גדול לפחות כמו הרדיוס של העצם הגדול ביותר בתמונה שאינו חלק מהרקע. לתמונות של 16 סיביות ו- 32 סיביות, הרדיוס צריך להיות ביחס הפוך לטווח ערכי הפיקסלים.
- קבע את ערכי הסף האוטומטיים השונים שבהם ייעשה שימוש
- פתח את הקרנות Z שנשמרו בשלב הקודם (6.2.6) ובחר תמונה | התאמה | סף אוטומטי | נסה הכל.
- מכיוון שתמונת תוצאת סף בינארית תופיע עם כל אלגוריתמי הסף האוטומטי השונים, קבע את האלגוריתם המתאים ביותר עבור התמונות.
- בעת הפעלת המאקרו מאוחר יותר, שנה את הסף בהגדרות המאקרו בהתאם.
- השתמש בספים מגבילים יותר כגון "RenyiEntrophy" או "רגעים" כסף המתווה של NMJ ובערכי סף מתירניים יותר כגון "Li" כדי לקבוע את השלד של NMJ, ו- "Huang" כדי לקבוע אזורים פעילים. כאשר התמונות חדות מאוד עם מעט רקע או ללא רקע, השתמש ב- "Huang" בתור סף חלוקה לרמות של NMJ. אחרת, ייתכן שחלקים מהסינפסה יהיו חסרים לאחר פילוח התמונה.
- ראו לדוגמה איור 2B. פילוח מתאים של הסינפסה מתקבל עם ספים אוטומטיים מודגשים על ידי תיבות ירוקות. כמה דוגמאות לספים לא מתאימים מודגשים בתיבות אדומות (בדוק סינפסות בהגדלה גבוהה). באחרון, חלקים של הסינפסה חסרים או חלקים של הרקע כלולים.
- קבע את הגודל המרבי של החלקיקים הקטנים
NOTE: פונקציה זו לא תכלול את כל החלקיקים שזוהו על ידי סף המתאר של NMJ וסף השלד הקטנים מהערך המוגדר ב"הגדרת חלקיקים קטנים" מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים. פונקציה זו משמשת כמסנן רעשים והיא שימושית מאוד כאשר קיימים שיעורים גבוהים של רקע לא אחיד (כגון גבישים/אבק) בתמונות המתקבלות.
- פתח את הקרנות Z שנשמרו בשלב 6.2.6. והגדר את קנה המידה לזיהוי מספר פיקסלים באמצעות ניתוח | הגדר קנה מידה. החל את ההגדרות הבאות: מרחק בפיקסלים = 1, מרחק ידוע = 1, יחס גובה-רוחב של פיקסל = 1, יחידת אורך = פיקסל ולחץ על "אישור". לחץ על הכלי "בחירה אליפטית" בסרגל הכלים.
- באמצעות העכבר ציירו ברירה סביב חלקיקים בודדים שנמצאים במערכת החיסון אך אינם שייכים ל-NMJ. הקש Ctrl+m עבור משתמש Windows או cmd+m עבור משתמשי Mac. ייפתח חלון תוצאות, המציין את אזור החלקיקים שנבחרו במספר הפיקסלים.
- חזור על השלב הקודם מספר פעמים עם מספר לכלוכים נוכחים בתמונות כדי לקבוע את אזור החלקיק/חפץ המזהם הגדול ביותר. זה יהיה הערך שיש להגדיר בהגדרה בעת הפעלת המאקרו מאוחר יותר. בעת הפעלת המאקרו, הגדר את "גודל חלקיקים קטנים" כגודל החלקיק הקטן ביותר שנצפה מוגלה, שוליים של 25%.
- ראו לדוגמה איור 2D. הגביש הגדול ביותר שזוהה הוא בעל שטח של 112 פיקסלים. ההגדרה "גודל חלקיקים קטנים", בעת עיבוד תמונה זו עם המאקרו, צריכה להיות מוגדרת ל- 125 - 150.
- קבע גודל בוטון מינימלי
NOTE: פונקציה זו לא תכלול את כל הבוטונים שזוהו על-ידי סף החלוקה לרמות של NMJ הקטנים מהערך המוגדר מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים.
- בצע את אותם השלבים המתוארים בסעיף 6.4, אך במקרה זה צייר בחירה סביב הבוטונים הקטנים ביותר הקיימים במסוף NMJ. בחר את האזור הקטן ביותר המתאים bouton הקטן ביותר של אלה שנמדדו. זהו הערך שיש להגדיר בהגדרת גודל הבוטון המינימלי בעת הפעלת המאקרו מאוחר יותר.
- הגדרת ערך "עמידות מקסימלית לרעש"
- כדי להגדיר את הערך "מצא סובלנות מרבית לרעשים" עבור המאקרו, פתח את ערוץ 2 Z-stack שנשמר בסעיף 6.2.2.
- עבור לכרטיסייה תוספים בתפריט הקופץ, בחר תהליך | מקסימום (תלת-ממד), וכאשר maximum_image_name מופיע (פעולה שעשויה להימשך מספר דקות), סגור את אוסף התמונות המקורי.
- בחר את Maximum..._image_name (אוסף התמונות החדש שהושג) ובחר תוספים | תהליך | מינימום (3D), כאשר התמונה החדשה מינימום של Maximum..._image_name אגסים סוגרים את מקסימום... _image_name ערימה.
- בסרגל הכלים, בחר תהליך | מצא מקסימום. חלון חדש "מצא מקסימום..." ייפתח. לחץ על תיבת הסימון "תצוגה מקדימה של בחירת נקודה..." ומלא את התיבה "סובלנות לרעש" בהגדרת המאקרו המוגדרת כברירת מחדל 50. נקודות המקסימום יסומנו בתמונה כצלבים קטנים.
- הגדל את הערך "עמידות לרעש" אם אתה צופה בעודף של אזורים פעילים מבוארים, כלומר הצלבות שאינן מעל אזורים פעילים שאינם ממוקדים במישור המחסנית שנבחר, או אזורים פעילים שגויים המזוהים ברקע.
- מצד שני, אם מתבוננים באזורים פעילים עם הערות חלקיות, כלומר אזורים פעילים בפוקוס שאינם מזוהים, מפחיתים את הערך "סובלנות לרעש מקסימלית". המשך לנסות ערכים שונים לאחר הליך זה עד שהצלבים יתייגו כראוי אזורים פעילים במיקוד. מלא את "מצא סובלנות רעש מקסימלית" עם ערך זה.
- ראו לדוגמה איור 2C. יותר מדי אזורים פעילים מזוהים. באיור 2C' רק האזורים הפעילים במוקד מזוהים בעת הגדלת הערך "Maxima noise tolerance".
- הפעל את מאקרו המשנה "נתח" עבור התמונות המייצגות שנבחרו בשלב 5.1, כאשר ההגדרות הוגדרו בכל השלבים הקודמים.
- התאמת סף Brp-puncta תחתון ועליון
- שים לב שקובץ חדש יופיע לאחר הפעלת המאקרו בהתאם לשלב 6.6, שנקרא 2_active_zone_stack_image_name. בערימת תמונות זו, האזורים הפעילים שזוהו על-ידי הפונקציה "Find maxima" מסומנים בנקודות לבנות בכל מישור.
- פתח קובץ זה על-ידי גרירתו ושחרורו בסרגל הכלים ובחר תמונה | ערימה | פרויקט Z | סוג הקרנה = סכום פרוסות. תתקבל הקרנה של 2_active_zone_stack_image_name.
- בחר תמונה | התאמה | סף. חלון חדש "סף" ייפתח. החלק את הסרגל העליון כדי לבחור ערך סף שבו, כל המוקדים הרצויים/נקודות חיוביות Brp מוצגים באופן חזותי באדום.
NOTE: אם הסף מוגדר נמוך מדי, ייספר עודף של אזורים פעילים. אם הוגדר גבוה מדי, חלק קטן מהאזורים הפעילים יוחמץ.
- ראו לדוגמה איור 2E. כאשר הסף מוגדר ל- 400, רוב האזורים הפעילים (המסומלים כמוקד של פיקסל אחד) אינם נכללים בסגמנטציה, מאחר שהם אינם מסומנים באדום (איור 2E). כאשר הסף מוגדר לערך של 50, כל האזורים הפעילים מסומנים באדום (איור 2E').
- הגדר ערך זה כסף מינימלי. השאר את "סף פונקטה עליון" בערך המרבי.
- הפעל מחדש את מאקרו המשנה "נתח" עבור התמונות המייצגות עם ההגדרות שהוגדרו בכל השלבים הקודמים של סעיף זה. הערך באופן ביקורתי את קובצי התמונה המתקבלים וודא שהסגמנטציה נעשית כראוי. אם זה לא המצב, התאימו מחדש את ההגדרות בהתאם לאופי טעויות הפילוח (איור 1, טבלה 1).
