פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model לחקר התחדשות עצבית במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר אבלציה של אקסונים בלייזר דו-פוטוני בזחל Drosophila melanogaster ופרוטוקול לדוגמה לגרימת פציעה ותמונה של אתר הפגיעה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Study Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. פגיעה בשני פוטונים והדמיה קונפוקלית

1. הגדרת מיקרוסקופ
   NOTE: מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם לייזר של שני פוטונים שימש לניסוי זה, אך גם מערכות אחרות עם מערך מקביל יספיקו. לייזר שני פוטונים (930 ננומטר) שימש להעברת פציעות ולייזר ארגון (488 ננומטר) שימש להדמיה קונפוקלית של GFP.
   1. בתחילת כל הפעלה, הפעל את הלייזר הדו-פוטוני ו/או את הלייזר הקונפוקלי ואת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת ההדמיה.
   2. עבור פגיעה בשני פוטונים, הגדר את הפרמטרים הבאים עבור הדמיה GFP עם לייזר שני פוטונים ב 930 ננומטר (1,950 mW).
      1. בחר מצב סריקת שורה. פתחו את חור הסיכה עד הסוף. הגדל את עוצמת הלייזר ל~20% (390 mW).
      2. בחר 512 x 512 כסריקת המסגרות. השתמש במהירות סריקה מרבית (בדרך כלל עם זמן השהייה של הפיקסלים ב- 0.77 μs). ודא שהמספר הממוצע הוא 1 ועומק הסיביות הוא 8 סיביות.
      3. הגדר את הרווח ל- ~750, ואת ההיסט ל- 0.
      4. שמור פרוטוקול ניסויי מוגדר מראש זה כ- 2P GFP 930 Ablation, המאפשר שימוש חוזר קל בניסויים עתידיים.
   3. עבור הדמיה קונפוקלית, הגדר את הפרמטרים הבאים עבור הדמיה GFP עם לייזר ארגון ב 488 ננומטר:
      1. בחר בכרטיסיה רכישה ולאחר מכן Z-stack.
      2. תחת "לייזר", הפעל את הכוח עבור לייזר ארגון 488 ננומטר.
      3. עבור אל ערוצים, בחר את הלייזר 488 מ"מ והגדל את עוצמת הלייזר ל 5-10%. עבור חור הסיכה, השתמש ביחידה אוורירית 1-2 (AU). התאם את הרווח ל- 650.
      4. במצב רכישה, בחר 1024 x 1024 כסריקת המסגרות, השתמש במהירות הסריקה המרבית, במספר ממוצע של 2 ובעומק סיביות של 8 סיביות.
      5. שמור פרוטוקול ניסיוני מוגדר מראש זה כהדמיית GFP.
2. הרדמת זחלים עם אתר דיאתיל והרכבה
   1. בתוך מכסה אדים, מניחים צלחת זכוכית בקוטר 60 מ"מ בתוך צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ. קפלו והניחו פיסת נייר טישו בתחתית צלחת הזכוכית, ואז הניחו צלחת אגר מיץ ענבים על הרקמה. מוסיפים אתר דיאתיל לתוך צלחת הזכוכית, עד כדי כך שנייר הטישו ספוג ונשארת שכבה של אתר נוזלי בצלחת. יש להשאיר את המכסה דולק בכל עת.
   2. הכינו מגלשת זכוכית עם טיפה אחת של שמן הלוקרבון 27 במרכז. הוסיפו 4 כתמים של שומן ואקום על ארבע פינות המגלשה, כדי לתמוך מאוחר יותר בכיסוי.
   3. השתמשו במלקחיים כדי להרים זחל נקי והניחו אותו על צלחת האגר בכלי זכוכית בקוטר 60 מ"מ. מכסים את צלחת הזכוכית במכסה שלה ומחכים עד שהזחל מפסיק לנוע. עבור פציעה/הדמיה של PNS, הוציאו את הזחל ברגע שהזנב שלו מפסיק להתעוות. עבור CNS, לחכות עד הזחל כולו הופך ללא תנועה, במיוחד קטעי הראש.
      NOTE: עיתוי החשיפה לאתר הוא קריטי. ראה דיון.
   4. בזהירות להרים את הזחל מורדם ולהניח אותו זקוף לתוך טיפת שמן halocarbon על המגלשה. הוסף תלוש כיסוי מעל השקופית. השתמשו בלחץ עדין כדי ללחוץ מטה על הכיסוי, עד שהוא נוגע בזחל (איור 1A).
   5. התאימו את מיקום הזחל על ידי דחיפה עדינה של הכיסוי שמאלה או ימינה כדי לגלגל את הזחל, כך שתא העצב/אקסון/דנדריט המעניין יהיה בחלק העליון והקרוב ביותר לעדשת המיקרוסקופ.
   6. במקרה של פציעת PNS, הרכיבו את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה, כך ששני קנה הנשימה גלויים. לאחר מכן גלגלו את הזחל ~30 מעלות שמאלה לפגיעה באקסונים של תא עצב מסוג III da (איור 1B ו-1C), 90 מעלות לפגיעה באקסונים של תא עצב מסוג IV da (איור 1B ו-1E), או ~30 מעלות לפגיעה בדנדריטים של תא עצב מסוג IV (איור 2A).
   7. במקרה של פגיעה במערכת העצבים המרכזית, מקמו את הזחל כך שיהיה גחוני בצורה מושלמת כלפי מעלה (איור 3A), כך שאזור העניין יהיה הקרוב ביותר לעדשת המיקרוסקופ במישור z.
3. פגיעה על ידי לייזר שני פוטונים
   1. הניחו את המגלשה עם הזחל מתחת למיקרוסקופ ואבטחו אותה במקומה עם מחזיק המגלשה על הבמה. השתמש במטרה 10X (0.3 NA) כדי למצוא את הזחל.
   2. הוסיפו טיפה אחת של שמן אובייקטיבי על הכיסוי, עברו למטרה 40X (1.3 NA) וכווננו את המיקוד.
   3. עבור למצב סריקה ועשה שימוש חוזר בפרוטוקול הניסוי 2P GFP 930 Ablation. ודא כי חור הסיכה פתוח עד הסוף.
      NOTE: יש למטב את התצורה בהתבסס על מערכות בודדות.
   4. הפעל את מצב Live כדי לאתר את אזור העניין (ROI), וכוונן את ההגדרות כדי להשיג איכות תמונה טובה עם זום מתאים.
      NOTE: מטרת שלב זה היא למצוא את תא העצב/אקסון/דנדריט לפצוע, במקום לצלם את התמונה באיכות הטובה ביותר. לכן, השתמש בהגדרות המינימליות המספיקות כדי לדמיין את אזור היעד, על מנת למנוע חשיפת יתר או הלבנה.
   5. הפסק סריקה חיה, כדי שלחצן החיתוך יהפוך לזמין. תנו לתמונת הסטילס לשמש כמפת הדרכים. בחר את הפונקציה חיתוך והתאם את חלון הסריקה כדי להתמקד במטרה להיפצע.
   6. צמצם את החזר ההשקעה כך שיהיה בגודל של אתר הפציעה הפוטנציאלי. לדוגמה, פשוט לכסות את רוחב של אקסון או דנדריט, כדי להבטיח את הדיוק של הפציעה ולהפחית את הנזק לרקמות שכנות. אם תרצה, התקרב להחזר ההשקעה לפני החיתוך, מה שמאפשר פציעה מדויקת יותר.
   7. פתח חלון הדמיה חדש. הפחת את מהירות הסריקה והגבר את עוצמת הלייזר. קבע את העלייה בעוצמת הלייזר בהתבסס על אות הפלואורסצנטיות של הרקמה שנסרק במצב חי.
   8. בדרך כלל, הגדר את עוצמת הלייזר של שני פוטונים החל מ- 25% עבור פציעת PNS ו- 50-100% עבור פגיעת VNC. עבור פגיעה באקסון PNS, ודא שעוצמת הלייזר היא ~ 480 mW וזמן השהייה של פיקסלים הוא 8.19 μs. עבור פציעת אקסון VNC, ודא שעוצמת הלייזר וזמן השהייה של הפיקסלים הם בדרך כלל 965-1930 mW ו- 8.19-32.77 μs, בהתאמה.
   9. התחל סריקה רציפה. השאר את הסמן מרחף מעל לחצן רציף. עקוב מקרוב אחר התמונה ועצור את הסריקה ברגע שנצפתה עלייה דרסטית בפלואורסצנטיות.
      NOTE: הופעת הספייק הפלואורסצנטי נובעת מפלואורסצנטיות אוטומטית באתר הפציעה.
   10. חזור למצב Live על-ידי שימוש חוזר בהגדרות. מצא את אזור העניין שזה עתה הוגדר כמטרה על-ידי התאמת המיקוד.
       NOTE: אינדיקציה טובה לפציעה מוצלחת היא הופעתו של מכתש קטן, מבנה דמוי טבעת, או פסולת מקומית ממש במקום הפגיעה.
   11. עברו לתא העצב הבא וחזרו על הפעולה משלב 1.3.5, כדי לפצוע תאי עצב מרובים בחיה אחת. לחלופין, חזור על שלב 1.3.5 תוך הגדלה הדרגתית של העוצמה ו/או הפחתת מהירות הסריקה אם הפציעה הראשונית לא הייתה מספקת.
       NOTE: במקרה שעוצמת הלייזר גבוהה מדי, אזור גדול שניזוק ייראה בתמונת הסריקה החיה שלאחר הפציעה. פגיעה רבה מדי עלולה לגרום למוות של הזחל.
   12. לשחזר את הזחל על ידי הסרת בזהירות את הכיסוי והעברת הזחל הפגוע על צלחת חדשה עם משחת שמרים. תעלה כמה מערות על צלחת אגר עם מלקחיים; לחילופין, הכינו אי של אגר בצלחת במקום להשתמש בצלחת כולה, כדי לצמצם את האפשרות שהזחל יזחל החוצה מהצלחת.
   13. שים את הצלחת בצלחת פטרי 60 מ"מ עם רקמה רטובה (ספוגה בתמיסת חומצה פרופיונית 0.5%) ותרבית בטמפרטורת החדר או 25 ° C.
       NOTE: הזחל יישאר בשלב הזחל כיום נוסף בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) לעומת 25 מעלות צלזיוס.
4. הדמיה קונפוקלית לאחר פציעה
   1. דמיינו את הזחל הפגוע בנקודות הזמן הרצויות על ידי הכנת הזחל באותו הליך של הרדמה והרכבה כמו בשלב 1.2, ולאחר מכן הדמיה עם לייזר קונפוקלי.
      NOTE: דמיינו את הזחל ב-24 שעות לאחר הפציעה (AI) כדי לאשר פגיעה אקסונלית וב-48 שעות AI (תאי עצב מסוג IV) או 72 שעות AI (תאי עצב מסוג III da) כדי להעריך רגנרציה.
   2. אתר את הזחל באמצעות המטרה 10X, ולאחר מכן עבור למטרה של 25X (0.8 NA). שימוש חוזר בפרוטוקול הניסויי GFP Imaging.
   3. לחץ על הלחצן Live ומצא את אותו תא עצב שנפגע בעבר.
   4. הגדר את מיקום Z הראשון והאחרון בחלון הסריקה החיה. לחץ על stop ולחץ על Start experiment כדי לקבל תמונת Z-stack.
      NOTE: ודא שנקודת נורמליזציה (נקודת ההתכנסות של אקסון) כלולה בעת לכידת תמונות, כך שכימות של התחדשות אפשרי (איור 1D, 1F) – נושא זה נדון בהמשך בסעיף ניתוח הנתונים.
   5. עבור לעיבוד תמונה, בחר את התמונה שזה עתה צולמה וצור הקרנה בעוצמה מרבית. שמרו הן את תמונות z-stack והן תמונות הקרנה בעוצמה מרבית.

תוצאות

איור 1: רגנרציה של אקסון נוירון בפריפריה מציגה ספציפיות מחלקתית. (א' ו-ב') ציור סכמטי המציג את מיקום הזחלים. (C) ציור סכמטי של תאי עצב מסוג III da. (D) אקסונים מסוג III da neurons ddaF, המסומנים ב-19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, אינם מצליחים לצמוח מחדש. (E) ציור סכמטי של תאי עצב מסוג IV da. (F) אקסונים מסוג IV da neurons v'ada, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתר דיאתיל, מגיב ACS, נטול מים	אקרוס אורגניקס	AC615080010
Halocarbon 27 שמן	ג'נסי סיינטיפיק	59-133
חומצה פרופיונית	ג'יי טי בייקר	U33007
כיסוי משקפיים: מלבנים	פישר סיינטיפיק	12-544-ד	50 מ"מ X 22 מ"מ
מיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss LSM 880	זיס
תוכנת זן	זיס
זיקית אולטרה II	קוהרנטית