$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה מובא מתוך Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. תכנון MBs להדמיית תאים חיים
- קפלו את רצף רנ"א המטרה כדי לחזות את המבנה המשני של מטרת ה-mRNA באמצעות "צורת הרנ"א" משרת ה-mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- הדבק/העלה את רצף היעד בפורמט FSTA, בחר 5 או 10% תת-אופטימליות (מבנים עם אנרגיה חופשית של קיפול בתוך 5 או 10% מערך MFE, בהתאמה), והתאם את המספר המרבי של קיפולים מחושבים בהתאם (למשל גדול יותר עבור 10% תת-אופטימליות).
NOTE: הכללת מבנים משניים תת-אופטימליים בעת תכנון MBs מאפשרת זיהוי אזורים בתוך mRNA המטרה שעשויים להיות גמישים יותר או קשיחים יותר ממה שנחזה עבור מבנה האנרגיה החופשית המינימלית (MFE) בלבד, מה שמשפר את התכנון הכולל של MBs המתאימים לדימות תאים חיים.
- בחר "משימה מיידית" עבור מטרות mRNA של 800 נוקלאוטידים (nt), או "משימת אצווה" עבור אורכי mRNA בין 801 ל 8,000 nt. שמור את הקובץ "ss-count" כקובץ טקסט פשוט.
- השתמש בקובץ "ss-count" שהתקבל בשלב 1.1 כקלט עבור תוכנית PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) עם הפרמטרים הרצויים, כדי לתכנן מספר MB עבור יעד mRNA (ראה הדרכות המתארות את השימוש בתוכנית PinMol בכתובת https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- קבע את הספציפיות של MBs נבחרים על ידי ביצוע ניתוח BLAST: השתמש ב- "blastn" עם מסד הנתונים המתאים (לדוגמה, עבור MBs ספציפיים ל- mRNA של oskar השתמש במסד הנתונים "refseq-rna" ובאורגניזם Drosophila melanogaster).
- זהה כל ביטוי ספציפי לרקמה של מטרת mRNA (למשל עבור oskar mRNA Flybase> נתוני ביטוי בתפוקה גבוהה> FlyAtlas Anatomy Microarray או modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) והשווה עם כל להיטי BLAST חיוביים. סלק בדיקות המראות >50% הומולוגיה צולבת עם mRNA אחרים המתבטאים גם ברקמה/תא המעניין.
- בחר את זוג הפלואורופור והמרווה המתאים למערך המיקרוסקופ הזמין לביצוע הדמיה חיה של תאים (לדוגמה, Cy5/BHQ2).
2. סינתזה, טיהור ואפיון של MB
- השתמש בסינתזה וטיהור פנימיים כפי שתואר קודם לכן ב- Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), או בשירותים מספקים מסחריים, כדי לסנתז ולטהר אחד עד חמישה MB (ראה הערה לעיל), באמצעות סכימת התיוג הבאה: [5'(Fluorophore)-(C3 או C6 linker)-(2'-O-methyl MB sequence)-(Quencher)3']. לטהר MBs באמצעות HPLC שלב הפוך, בבית או באמצעות השירותים של הספק המסחרי.
NOTE: הפוספורמידיט המשמש לסינתזה אוטומטית של בדיקה חייב להיות בעל שינוי ריבונוקלאוטיד 2'-O-מתיל. אפשר גם להשתמש בכימרות של שינויים לסירוגין של חומצת גרעין נעולה (LNA) ו-2'-O-methyl כדי להגביר את היציבות של הכלאה בין MB קצר יותר לבין mRNA המטרה שלו.
- לסנתז אוליגונוקלאוטידים של DNA התואמים את רצף אזור ה-RNA הממוקד ובכך משלימים את אזור הבדיקה של MBs, לשימוש באפיון במבחנה (ראה שלבים 2.3 עד 2.5; הערה לעיל). למקסם את ההכלאה של ה-MB עם חיקוי המטרה של ה-DNA-אוליגונוקלאוטידים, על ידי הכללת ארבעה נוקלאוטידים נוספים בכל קצה של יעד ה-DNA, כפי שנמצא ברצף mRNA המטרה.
NOTE: אפיון קפדני יותר של יעילות ה-MB לזיהוי רצף המטרה יכול להתבצע באמצעות מטרות RNA מסונתזות במבחנה במקום אוליגונוקלאוטידים משלימים של DNA.
- בצע דנטורציה תרמית של ה-MB בלבד, מדוד את טמפרטורת ההתכה שלו (Tm), ואשר שה-MB מניח את צורת סיכת השיער הרצויה בטמפרטורה פיזיולוגית. ראינו ערכי מדיטציה טרנסנדנטלית בין 60 ל-90 מעלות צלזיוס.
- לבצע דנטורציה תרמית של ה-MB בנוכחות המטרה אוליגונוקלאוטיד של ה-DNA ולמדוד את ה-TM של יעד MB:DNA, כפי שתואר קודם לכן ב-Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Tm בין 55 ל 60 ° C רצוי עבור MB:DNA היברידי.
- לבצע תגובות הכלאה במבחנה עם היעד אוליגונוקלאוטיד DNA המתאים, ולקבוע את היעילות של היווצרות היברידית MB:DNA בטמפרטורה פיזיולוגית, כפי שתואר קודם לכן ב- Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). קינטיקה של הכלאה מהירה עם חיקוי מטרת הדנ"א רצויה, אולם MBs שאינם מראים יעילות הכלאה גבוהה עם מטרות DNA עשויים להיות בעלי ביצועים טובים יותר עם mRNA המטרה במבחנה ו / או in vivo.
3. דיסקציה והכנה של תאי ביציות בודדים למיקרו-הזרקה
- האכילו נקבות שזה עתה בקעו והזדווגו במשך 2-3 ימים עם משחת שמרים טריים.
- להרדים זבובים על כרית CO2, ובאמצעות פינצטה עדינה (Dumont #5), להעביר 1-2 נקבות לתוך טיפה של שמן Halocarbon 700 על כיסוי זכוכית.
- באמצעות זוג פינצטה, לכוון את הזבוב עם הצד הגבי כלפי מעלה תחת סטריאומיקרוסקופ. לנתח את הבטן הנשית על ידי ביצוע חתך קטן בקצה האחורי ולסחוט בעדינות את זוג השחלות לתוך השמן.
- יש למרוח את השחלות על טיפת שמן על מכסה חדש. החזיקו בעדינות שחלה אחת בפינצטה אחת תוך צביטת השלבים הצעירים ביותר של השחלה עם הפינצטה השנייה. oskar mRNA ממוקם באופן פעיל באמצע האוגנזה ולאחריה (שלבים > 7), ותאי ביציות צעירים יותר (שלבים < 7) קשים יותר להזרקה ואינם שורדים זמן רב. גררו באיטיות את החלקת הכיסוי (בתנועה כלפי מטה) עד ששחלות בודדות או תאי ביציות בודדים מבודדים ומיושרים אנכית. הפרדה נוספת בין תאי ביצית בודדים על ידי הרחקת השלבים הלא רצויים משרשרת ביציות השחלה.
NOTE: יש לוודא שתאי ביצים נפרדים אינם צפים בשמן, ושהם נצמדים לתלוש הכיסוי. זה חשוב הן למיקרו-הזרקה מוצלחת והן לרכישת תמונה.
4. מיקרו-הזרקה של MBs לתאי האחיות של תאי הביציות
- הכינו את תמיסת ה-MB באמצעות משואה מולקולרית אחת (למשל osk2216Cy5), או שילוב של שני מגה-בתים המכוונים ל-mRNA שונים ואשר מסומנים בפלואורופורים מובחנים ספקטרלית (למשל osk2216Cy5 ו-drongo1111Cy3). יש להשתמש בריכוז של 200-300 ננוגרם/מיקרוליטר כל MB ב-HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 ו-100 mM NaCl). עבור קוקטייל של ארבעה מגה-בתים המסומנים באותו פלואורופור המכוונים לאותו mRNA ב-200 ננוגרם/μL כל אחד ב-HybBuffer (למשל osk82, osk1236, osk2216). סובב את תמיסת MB מיד לפני טעינת המחט למיקרו-הזרקה.
- בחר את המטרה. מטרת שמן 40x מומלצת למציאת תא ביצית מתאים ולביצוע מיקרו-הזרקה.
- הרכיבו את הכיסוי עם תא הביצים המנותחות על במת המיקרוסקופ. להעלות את המטרה בתנוחת המיקוד ולזהות תא ביצית בשלב התפתחותי בינוני עד מאוחר, המכוון כראוי למיקרו-הזרקה (כלומר, כאשר ציר AàP ניצב לקצה המחט כדי לאפשר הזרקה קלה בתוך תא אחות קרוב לביצית).
- טען מחט (מסחרית או מוכנה בבית) עם ~ 1 μL MB פתרון (ראה שלב 1.1) וחבר אותו microinjector. עבור מיקרו-הזרקות בתאי ביצים של D. melanogaster, כוונו את המחט (ראו טבלת חומרים) בזווית <45° לשלב המיקרוסקופ (למשל 30°) כדי למנוע ניקוב מספר תאי אחות.
- הגדר את המזרק בלחץ הזרקה של 500-1,000 hPa ולחץ פיצוי של 100-250 hPa (ראה טבלת חומרים).
- הזיזו לאט את הבמה כדי להכניס לשדה הראייה אזור של טיפת השמן ריק מתאי ביצים.
- באמצעות ג'ויסטיק מיקרומניפולטור, להוריד בעדינות את המחט לתוך טיפת השמן ולהביא את קצה שלה להתמקד לכיוון הפריפריה של שדה הראייה.
- בצע פונקציה 'נקייה' כדי להסיר את האוויר מקצה המחט ולוודא שיש זרימה מהמחט.
- הביאו את המחט למצב ביתי והתמקדו בתא הביצה להזרקה מיקרו, ואז החזירו את המחט למיקוד ומקמו אותה קרוב לקצה תא הביצה.
- בצע התאמה עדינה של מיקום Z של המטרה כך שהקרום המפריד בין תאי הזקיק לתאי האחות יהיה ממוקד.
- הכנס את המחט לתא אחות ובצע הזרקה במשך 2-5 שניות.
- הסר בעדינות את המחט ומשוך אותה למצב ביתי.
- שנו את המטרה להגדלה הרצויה לרכישת תמונה (60-63x או 100x), התמקדו בתא הביצים והתחילו ברכישה.