סינון שינויים גנומיים: שיטה לזיהוי מוטציות שנוצרו על ידי קריספר בדרוזופילה

תקציר

מקור: Du, L., et al. אסטרטגיה יעילה ליצירת מערכות שעתוק בינאריות ספציפיות לרקמות בדרוזופילה על ידי עריכת גנום. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר שיטת סינון לזיהוי זבובי דרוזופילה טרנסגניים, שהגנום שלהם שונה באמצעות CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 הוא כלי רב עוצמה לעריכת גנום שחולל מהפכה באופן שבו מדענים יכולים לתמרן את הגנום של אורגניזם. בפרוטוקול לדוגמה, נראה כיצד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי קריספר, שבו החדרה של רצף טרנסאקטיבציה מחליפה את האקסון הראשון של הגן חסר הענף (bnl), ובכך יוצרת קו דרייבר ספציפי לגן bnl, bnl-LexA.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. גנטיקה של זבובים ובדיקות סקר (איור 1 ואיור 2)

1. כאשר העוברים המוזרקים מתפתחים לבוגרים, חוצים כל זבוב G₀ בודד כדי לאזן את הזבובים. בחר איזון מתאים לכרומוזום המכיל את אלל המטרה.
2. מרדימים את צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית CO₂ ובוחרים באופן אקראי 10-20 זכרים תחת סטריאומיקרוסקופ. חצו אותם בנפרד לנקבות המאזנות, כפי שמוצג באיור 2.
3. כאשר זחלי F2 בוקעים, יש לבחור את האב היחיד של F1 מכל צלב ולחלץ gDNA באמצעות פרוטוקול הכנת DNA גנומי של זבוב יחיד:
   1. הכינו מאגר מיצוי gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, יש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסת מלאי פרוטאינאז K במינון 20 מ"ג/מ"ל ואחסנו במקפיא.
   2. הכניסו כל זבוב לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ותייגו את הצינור. יש לשמור במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
   3. הכינו נפח עבודה טרי של מאגר מיצוי gDNA המכיל ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם/מ"ל של פרוטאינאז K.
      הערה: אל תשתמש במאגר ישן עבור שלב זה.
   4. מעכו כל זבוב במשך 10–15 שניות עם קצה פיפטה המכיל 50 מיקרוליטר של חיץ מעוך מבלי לפזר את הנוזל. מוציאים את החיץ הנותר לתוך הצינור ומערבבים היטב. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 20-30 דקות.
   5. שים צינורות בלוק חום 95 ° C למשך 1-2 דקות כדי להשבית את Proteinase K.
   6. יש לסחוט כלפי מטה במשך 5 דקות במהירות של 10,000 x גרם. יש לאחסן את התכשיר בטמפרטורה של 4°C לניתוח PCR נוסף.
4. השתמש באותה שיטה כדי להכין gDNA מזבוב nos-Cas9, המשמש כבקרה שלילית. בצעו מסכים מבוססי PCR בשלושה שלבים כדי לזהות את ה-HDR הנכון (איור 1, איור 3) באמצעות gDNA של כל זכר F1 כתבנית⁵. השתמש 1 μL של הכנת DNA במערכת תגובת PCR הבאה: 10 μL של 2x PCR Master Mix עם צבע, 1 μL של כל פריימר (10 μM), 1 μL של תבנית DNA, ו 7 μL של ddH₂O.
5. כפי שמוצג באיור 3A, בצע PCR באמצעות פריימרים fwd1 ו-rev1 כדי לבדוק את קיומו של ההחדרה או ההחלפה; בצע PCR באמצעות פריימרים fwd2 ו-rev2 כדי לאמת את ההכנסה או ההחלפה מאזור 3'; בצע PCR באמצעות פריימרים M13F ו-rev3 כדי לבדוק HDR "קצוות" (טבלה 1C).
6. שמור על קווי הזבוב עם ה-HDR המאושר וקבע מלאי מאוזן מדור ה-F2. החוצה למאזן טס שוב כדי להסיר מוטציות לא מכוונות על כרומוזומים אחרים.

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של זרימת עבודה עבור עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 ליצירת מערכת שעתוק בינארית. משך הזמן המשוער הנדרש עבור כל שלב מצוין. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: איור של בדיקת CRI...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Tris-HCl	סיגמא אולדריץ'	T3253	ביולוגיה מולקולרית
EDTA	סיגמא אולדריץ'	E1161	ביולוגיה מולקולרית
NaCl	סיגמא אולדריץ'	S7653	ביולוגיה מולקולרית
מים נטולי DNase/RNase UltraPure	תרמופישר סיינטיפיק	10977-023	ביולוגיה מולקולרית
פריימרים	IDT-DNA		PCR
פרוטאינאז K	תרמופישר סיינטיפיק	25530049	ביולוגיה מולקולרית
2x PCR PreMix, עם צבע (אדום)	סידלאב	MB067-EQ2R	ביולוגיה מולקולרית
MKRS/TB6B	מעבדת קורנברג		קו טיסה
תחנת CO2	ג'נסי סיינטיפיק	59-122WCU	דחיפת זבובים
מיקרוסקופ סטריאו	אולימפוס	SZ-61	דחיפת זבובים
מיקרו-צינוריות הומוגניות מזיקים	פישר-סיינטיפיק	03-421-217	בידוד DNA גנומי