$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).
1. גנטיקה של זבובים ובדיקות סקר (איור 1 ואיור 2)
- כאשר העוברים המוזרקים מתפתחים לבוגרים, חוצים כל זבוב G0 בודד כדי לאזן את הזבובים. בחר איזון מתאים לכרומוזום המכיל את אלל המטרה.
- מרדימים את צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית CO2 ובוחרים באופן אקראי 10-20 זכרים תחת סטריאומיקרוסקופ. חצו אותם בנפרד לנקבות המאזנות, כפי שמוצג באיור 2.
- כאשר זחלי F2 בוקעים, יש לבחור את האב היחיד של F1 מכל צלב ולחלץ gDNA באמצעות פרוטוקול הכנת DNA גנומי של זבוב יחיד:
- הכינו מאגר מיצוי gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, יש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסת מלאי פרוטאינאז K במינון 20 מ"ג/מ"ל ואחסנו במקפיא.
- הכניסו כל זבוב לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ותייגו את הצינור. יש לשמור במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
- הכינו נפח עבודה טרי של מאגר מיצוי gDNA המכיל ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם/מ"ל של פרוטאינאז K.
הערה: אל תשתמש במאגר ישן עבור שלב זה.
- מעכו כל זבוב במשך 10–15 שניות עם קצה פיפטה המכיל 50 מיקרוליטר של חיץ מעוך מבלי לפזר את הנוזל. מוציאים את החיץ הנותר לתוך הצינור ומערבבים היטב. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 20-30 דקות.
- שים צינורות בלוק חום 95 ° C למשך 1-2 דקות כדי להשבית את Proteinase K.
- יש לסחוט כלפי מטה במשך 5 דקות במהירות של 10,000 x גרם. יש לאחסן את התכשיר בטמפרטורה של 4°C לניתוח PCR נוסף.
- השתמש באותה שיטה כדי להכין gDNA מזבוב nos-Cas9, המשמש כבקרה שלילית. בצעו מסכים מבוססי PCR בשלושה שלבים כדי לזהות את ה-HDR הנכון (איור 1, איור 3) באמצעות gDNA של כל זכר F1 כתבנית5. השתמש 1 μL של הכנת DNA במערכת תגובת PCR הבאה: 10 μL של 2x PCR Master Mix עם צבע, 1 μL של כל פריימר (10 μM), 1 μL של תבנית DNA, ו 7 μL של ddH2O.
- כפי שמוצג באיור 3A, בצע PCR באמצעות פריימרים fwd1 ו-rev1 כדי לבדוק את קיומו של ההחדרה או ההחלפה; בצע PCR באמצעות פריימרים fwd2 ו-rev2 כדי לאמת את ההכנסה או ההחלפה מאזור 3'; בצע PCR באמצעות פריימרים M13F ו-rev3 כדי לבדוק HDR "קצוות" (טבלה 1C).
- שמור על קווי הזבוב עם ה-HDR המאושר וקבע מלאי מאוזן מדור ה-F2. החוצה למאזן טס שוב כדי להסיר מוטציות לא מכוונות על כרומוזומים אחרים.
