$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.(2019).
1. הכנה וקיבוע
- הכינו Drosophila melanogaster (זבוב פירות).
- מרדימים זבובים בוגרים באמצעות 100% פחמן דו חמצני. הניחו מבוגרים מורדמים (כ-10 עד 30 זבובים) בבקבוקון קטן של מכסה בורג פלסטיק או בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
- יש לטבול זבובים מורדמים ב-1 מ"ל של חומר קיבוע (1.25% גלוטראלדהיד, 0.1 מ"ל חוצץ פוספט pH 7.2) למשך שעתיים (או לילה) ב-4°C. אם הזבובים צפים על פני השטח של הקיבוע, להוסיף כמה טיפות של 2.5% פוליאתילן גליקול tert-octylphenyl אתר כדי להחליש את מתח הפנים של קיבוע המאפשר שקיעה מוחלטת של הרקמה. הסר את הקיבוע באמצעות צינור זכוכית.
2. כביסה והתייבשות
- לשטוף ולייבש Drosophila melanogaster (זבוב פירות).
- שטפו את הדגימה הקבועה שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 M pH 7.2 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הסר כל כביסה עם פיפטה זכוכית, נזהר לא להסיר את הזבובים.
- יש לייבש את הדגימה באמצעות סדרת אתנול מדורגת, למשך 10 דקות בנפח של 1 מ"ל בצינור מיקרופוגה. ריכוזי האתנול הם: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. הסר את האתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא להסיר את הזבובים.
- שמור את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם מספיק אתנול 100% כדי לכסות את הדגימה לפני הייבוש.
3. ייבוש
- בצע ייבוש כימי באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS).
- החלף את תמיסת 100% אתנול בתמיסה 1:2 של HMDS ו-100% אתנול למשך 20 דקות. החלף את תמיסת 1:2 בתמיסה ביחס 2:1 של HMDS ו-100% אתנול למשך 20 דקות. החלף את תמיסה 2:1 בתמיסה 100% HMDS למשך 20 דקות. חזור על הפעולה פעם אחת.
הערה: HMDS הוא דליק ורעל חריף (מסלול עורי). יש לטפל ב-HMDS במכסה אדים כימי באמצעות ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מעיל מעבדה והגנה על העיניים.
- העבירו את הדגימה ב-HMDS, אם בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, לצלחת שקילת אלומיניום חד פעמית. לאחר הכניסה לצלחת השקילה מאלומיניום, החלף את 100% HMDS ב-100% HMDS טריים מספיק כדי לכסות את הדגימה.
- מעבירים את הדגימה למייבש פלסטיק או זכוכית שאינו ואקום עם חומר ייבוש טרי (5-6 ס"מ עומק) ומכניסים למכסה אדים כימי. לחלופין, הניחו את הדגימה ישירות במכסה אדים כימי לייבוש עם מכסה רופף, כגון קופסה, כדי למנוע נפילת פסולת על הדגימה. הניחו לדגימה להתייבש במשך 12 עד 24 שעות.
4. הרכבה
- הר Drosophila melanogaster (זבוב הפירות).
- תייגו את החלק התחתון של ספח ההרכבה מאלומיניום כדי לציין מה מונח למעלה.
הניחו את הזבובים המיובשים במיקום הרצוי על לשונית דבק או דבק פחמן המאובטחת לראש הגבעול תחת מיקרוסקופ מנתח עם פינצטה מדויקת.
- יש למרוח דבק מוליך כסף, כלומר צבע כסף, סביב הקצוות החיצוניים של הגבעולים. חברו את הצבע הכסוף לזבובים באמצעות קיסם כדי להבטיח מוליכות. אין לאפשר לצבע לגעת באזור ההדמיה הרצוי.
- הניחו את הגבעולים בקופסת מחזיק גיבוב והניחו את קופסת מחזיק הספח הפתוחה במייבש. הניחו לצבע הכסוף להתייבש לפחות 3 שעות או למשך הלילה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.