שיבוץ ראשי דרוזופילה בוגרים בפרפין: הכנת רקמות להיסטולוגיה

תקציר

מקור: Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. היסטולוגיה המונית לכימות ניוון עצבי בדרוזופילה . J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר כיצד להטמיע ראשי דרוזופילה בפרפין בשיטת הצווארון, טכניקה המכינה ראשי זבובים לחתך סדרתי. קטעי פרפין משמשים לבדיקות היסטולוגיות של האנטומיה של המוח ולהערכת ניוון עצבי. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד ניתן לעבד מספר זבובים בהכנה אחת, ובכך להגדיל את יעילות הזמן ולמזער ממצאים ניסיוניים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Sunderhaus and Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. קיבוע הראש על צווארונים והטבעה בפרפין

הערה: כל השלבים בתהליך הקיבוע צריכים להיעשות במכסה אדים. מתילבנזואט, אמנם אינו מהווה סיכון בריאותי, אבל יש לו ריח מאוד ברור, שיכול להיות מהמם אם לא מטפלים בו במכסה אדים.

1. לפני הרדמת הזבובים, לפצות 50 מ"ל של תמיסת קרנוי על ידי הוספת 15 מ"ל של כלורופורם ו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל 30 מ"ל של 99% אתנול (לא לערבב את הכלורופורם ואת חומצה אצטית). יוצקים אותו למיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת מתגבשת, כדי להבטיח שהקולרים יכולים להיות שטוחים ומכוסים לחלוטין על ידי התמיסה.
2. מרדימים את הזבובים עם CO₂ או אתר.
3. חוט עף (עד 20 עם רוב הצווארונים) על ידי הצוואר שלהם לתוך הצווארונים באמצעות מלקחיים. זכרו ליישר את כל הראשים באותו כיוון, כפי שניתן לראות באיור 1A, והיו עדינים כדי לוודא שלא נגרם נזק לראש או לעיניים.
4. כלול זבובי sine oculis (חצים, איור 1A) במיקומים אקראיים, כך שניתן יהיה לזהות בקלות את סדר הזבובים במקטעים. בנוסף, אם לזבובי הניסוי יש צבע עיניים בהיר או לבן, השחילו ביניהם כמה זבובים אדומי עיניים, כגון סוג פראי, כדי לוודא שיש מספיק פיגמנט כדי להכתים את המגלשה. רשום את סדר הזבובים על גיליון פרוטוקול יחד עם מספר הצווארון אם אתה משתמש ביותר מצווארון אחד.
5. לאחר סיום הצווארון, הניחו אותו בתמיסת קרנוי מוכנה למשך 3.5 - 4 שעות.
6. יש לזרוק את תמיסת קרנוי למיכל הסילוק המתאים ולהתחיל בשטיפות האתנול. הקפידו לשפוך לאט כדי לא להפריע למיקום הצווארונים במיכל.
7. שטפו את הצווארונים במשך 30 דקות באתנול 99% פעמיים.
8. שטפו את הצווארונים באתנול 100% למשך שעה אחת. הקפידו להחליף את השטיפות בזמן כדי למנוע התייבשות יתר.
9. שים את הצווארונים במתילבנזואט O/N ב- RT. אטם את המיכל עם פרפילם כדי למנוע אידוי של מתילבנזואט.
10. יוצקים את המתיל-בנוזט למיכל החד-פעמי המתאים במכסה האדים. הוסיפו תערובת שהוכנה מראש של 1:1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57°C), שעוות פרפין ומתילבנזואט. מנקודה זו ואילך, יש לשמור את הצווארונים באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהפרפין אינו מתקשה.
11. יוצקים את תערובת המתיל-בנוזל והפרפין למיכל החד-פעמי המתאים ויוצקים שעוות פרפין טהורה מותכת, הנשמרת בטמפרטורה של 65°C, על הצווארונים.
12. שנה את הפרפין לאחר 30 דקות וחזור על כך לפחות 5 פעמים. יש לבצע לפחות 6 - 8 שטיפות.
13. לאחר סיום השטיפות, הניחו את הצווארונים במגש קוביות קרח מגומי עם חריצים בערך בגודל הצווארונים. יוצקים עליהם פרפין מותך עד שהם מכוסים לחלוטין ומאפשרים לו להתקשות O/N (נסו להימנע מבועות אוויר).
14. הסר את קוביות הפרפין המכילות את הצווארונים ממגש קוביות הקרח. הפרידו את בלוק הפרפין מהצווארון באמצעות סכין גילוח, ושברו בעדינות את הצווארון. הראשים יהיו בבלוק הפרפין ואילו הגופות יישארו בצווארון. ניתן לשמור את הבלוקים בטמפרטורת החדר.
15. כדי לנקות את הצווארונים, השרו אותם בחומר deparafinization ב 65 ° C כדי להסיר את הפרפין, לנקות עם קרצוף קל, ולשטוף אתנול לפני שימוש חוזר.

תוצאות

איור 1: חתכים טוריים של פרפין. א) באמצעות שיטת הצווארון, ניתן לעבד זבובי ניסוי ובקרה כדגימה אחת על ידי השחלתם על צווארון אחד. זבובי סינוס אוקוליס, חסרי עיניים, מוכנסים לצורך התמצאות (חצים). B) סכמטי המראה את כיוון ראשי הזבובים בצווארון. C) בתמונה זו, מקטעים מראשי זבובים שונים מכוונים משמאל לימין בשקופית. מלמעלה למטה בשקופית, ניתן לראות קטעים טוריים מאותו ראש זבו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צווארון	ג'נסי סיינטיפיק	TS 48-100	אנו משתמשים בצווארונים בהתאמה אישית העשויים מחתיכת מתכת אחת במקום שכבות כמו אלה של Genesee.
מגש קוביות קרח גומי להטמעה	חנות ביתית		ניתן להתאים את הגודל על ידי הדבקה בקירות נוספים
מנה מגבשת	פישר סיינטיפיק קומפני	08-762-3
אתר	פישר סיינטיפיק קומפני	E138-1
אתנול	מעבדות דקון בע"מ	2701
כולורופורם	פישר סיינטיפיק קומפני	C298-500
חומצה אצטית קרחונית	פישר סיינטיפיק קומפני	A38-212
מתילבנזואט	פישר סיינטיפיק קומפני	M205-500	ריח מובחן - יש להשתמש במנדף!
נקודת התכה נמוכה שעוות פרפין	פישר סיינטיפיק קומפני	T565	הקפידו לשמור על תוספת המסה באמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס