פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Nazario-Toole and Wu, הערכת התגובה החיסונית התאית של זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).
1. הכנת חלקיקי פלואורסצאין להזרקה
- הרכיבו מחדש 10 מ"ג של חלקיקי חיידקים מומתים בחום הזמינים מסחרית המסומנים בפלואורסצאין (ראו טבלת חומרים) לריכוז מלאי של 10 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 990 מיקרוליטר סטרילי 1x PBS ו-10 מיקרוליטר 50 מ"מ נתרן אזיד. מערבולת לערבב.
- יש לחלק לאליציטוטים חד-פעמיים של 8 μL בצינורות של 0.2 מ"ל ולאחסן בקופסה חשוכה ב-4°C כדי למזער את הרגישות הקשורה לאור.
NOTE: חומר משמר נתרן אזיד הוא אופציונלי וניתן להשמיט אותו אם 10 מ"ג / מ"ל מלאי מיוצרים עם 1 מ"ל סטרילי 1x PBS, aliquoted, ומאוחסן ב -20 ° C.
- הפוך תמיסה 10 מ"ל של 5% צבע מאכל ב 1x PBS על ידי ערבוב מזרק 500 μL מסונן ירוק צבע מאכל ו 9.5 מ"ל סטרילי 1x PBS.
- יש לשטוף חלקיקים לפני ההזרקה כדי להסיר נתרן אזיד. יש לערבב 42 μL סטרילי 1x PBS ו-8 μL של 10 מ"ג/מ"ל בצינור של 1.7 מ"ל. צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הסופרנאטנט, מוסיפים 50 μL 1x PBS, וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 1.3 ו- 1.3.1 2x, לקבלת 3 כביסות בסך הכל.
- לאחר השטיפה הסופית, יש להשליך את חלקיקי הסופרנאטנט ולהשהות אותם מחדש ל-1.6 מ"ג/מ"ל ב-50 מיקרוליטר של 5% צבעי מאכל ב-1x PBS.
- עטפו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור. יש לאחסן ב-4°C, להשליך לאחר שבוע.
2. מכינים את תחנת ההזרקה והזבובים
- הכינו את כרית ההזרקה. כדי להזריק עד 4 גנוטיפים של זבובים בו זמנית, השתמש בסרט מעבדה כדי לחלק משטח זבוב CO2 מלבני ל -4 חלקים. על הספסל ליד המיקרוסקופ, הקצו אזורים למיקום הבקבוקונים לאחר שזבובים מסודרים בשורה על הפד (אחד לכל פינה של הפד).
- הכינו בקבוקונים של זבובים תואמי גיל, בני 4-7 ימים, להזרקה. כדי שכל זן ייבדק, העבירו 5 זכרים ו-5 נקבות לבקבוקון טרי מסומן של מזון זבובים מוכן ושמרו על טמפרטורה של 25°C.
- הכן את המזרק הפנאומטי (ראה טבלת חומרים) על ידי הגדרת המכשיר למצב TIMED של 100 מילישניות (התפרצויות קצרות של לחץ גז כדי להוציא את הנוזל - המאפשר העברת נפחים תת-ננו-ליטריים).
- הכינו את שקופיות המיקרוסקופ. חתכו רצועות של סרט חשמלי בקוטר 1.5 אינץ', קפלו ללולאה כשצד הדבק בחוץ, והניחו על שקופית מיקרוסקופ מסומנת.
3. הכינו מחטי זכוכית
- משוך מחטי זכוכית (נימי זכוכית דקים בקיר) באמצעות מושך מחט.
- החזק את המחט מתחת למיקרוסקופ עם מיקרומטר ושבור את הקצה באמצעות #5 פינצטה נירוסטה נקודה עדינה. קצוות של 100 מיקרומטר מספיקים כדי לחדור את הקוטיקולה של הזבוב תוך מזעור הפציעה.
- מדדו את נפח הנוזל שיוזרם לכל זבוב. טען את המחט עם צבע מאכל סטרילי 5% ב 1x PBS ולגרש את הנוזל על טיפת שמן מינרלי על מיקרומטר שלב 0.01 מ"מ.
NOTE: אם הטיפה הנוזלית היא כדורית, הנפח בפיקוליטרים מחושב כ- (גודל)3/1910. מחט בקוטר 100 מיקרומטר תפלט ~ 2 nL ב -100 אלפיות השנייה.
4. להזריק זבובים
- פיפטה 10 μL של 1.6 מ"ג / מ"ל חלקיקים על ריבוע קטן של parafilm.
- משוך את הנוזל לתוך המחט והרכיב בפיית המזרק (ראה טבלת חומרים).
- מרדימים זבובים עםCO2 ומעמידים אותם בשורה באזור המיועד להם על משטח הטיסה, כאשר הצד הגחוני כלפי מעלה והראשים מכוונים לקדמת הפד. מניחים בקבוקונים באזורים המתאימים על הספסל.
- להזריק זבובים בפינה העליונה של הבטן עם 5, 100 ms משאבות של נוזל (~ 10 nL בסך הכל).
- מעבירים את הזבובים המוזרקים לבקבוקונים המתאימים, מציינים את השעה על הבקבוקון. לשמור על טמפרטורה של 25°C.
- טען מחט חדשה עם 0.4% Trypan Blue Solution.
- הגדר את המזרק הפנאומטי למגודר, המאפשר זרימה קבועה של אוויר כדי לדחוף את הנוזל החוצה מהמחט.
- מרדימים זבובים לאחר מנוחה של 30 דקות ומזריקים עם Trypan Blue עד שהבטן מלאה ומרוחקת.
NOTE: כאשר בוחנים את הבשלת הפאגוזום עם חלקיקים המסומנים בצבע רגיש ל- pH, יש לאפשר לזבובים לנוח במשך שעה אחת ואל תזריק טריפאן כחול לפני הרכבת זבובים.
- הר טס על שקופיות מיקרוסקופ עם סרט חשמלי, הצד הגחוני כלפי מטה. דחפו את הכנפיים לצד הזבוב ואבטחו אותן לקלטת. כמו כן, לדחוף בעדינות את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.
