$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Bantel and Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. רעב
- הכינו בקבוקוני הרעבה לזבובים על ידי רוויית כדור צמר גפן במים של 18.2 MΩ בתחתית בקבוקון זבוב סטנדרטי. לחלופין, יש להרוות באופן דומה רצועה קטנה של נייר סינון במים של 18.2 MΩ ולהניח בזווית בתוך הבקבוקון.
- אספו זבובים לקבוצות של ~100 בעלי חיים על כרית CO2 ואז הוסיפו את הזבובים לבקבוקון מוכן.
NOTE: התוצאות הטובות ביותר מתקבלות עם בעלי חיים בני פחות מ -5 ימים. עם זאת, ניתן לשלוט בגיל המדויק של בעלי החיים כמשתנה ניסיוני כדי לקבוע שינויים בהעדפת הטעם לאורך זמן.
- השתמש בצמר גפן או פקק קצף כדי לאבטח את הבקבוקונים סגורים. מניחים בקבוקונים על צידם באינקובטור מבוקר סביבתי. שמור על הטמפרטורה ב 25 °C (75 °F), ואת הלחות מעל 70%. השאירו בקבוקונים ללא מגע למשך 24 שעות.
2. בדיקת העדפות טעם
- הכינו את כל הטעימות לבדיקה באותו יום של הבדיקה.
NOTE: הטעימות המדויקות בהן יש להשתמש ישתנו בהתאם לשאלה הניסיונית שתישאל. להלן דוגמאות לטעימות המשמשות בפרוטוקול זה. ראה סעיף 4 לאופטימיזציות.
- הכינו טעימת בקרה (1 מ"מ סוכרוז) על ידי שילוב של 10 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז 100 מ"מ, 13 מיקרוליטר של צבעי מאכל אדומים ו-977 מיקרוליטר של 18.2 MΩ מים.
- הכינו טעימות ניסיוניות (5 מ"מ סוכרוז) על ידי שילוב של 50 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז 100 מ"מ, 10 מיקרוליטר צבעי מאכל כחולים ו-940 מיקרוליטר של 18.2 MΩ מים.
- הכינו תאי בדיקה באמצעות צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטית בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ שהוכנה באופן הבא:
- מניחים 3 טיפות של 10 μl של טעימת בקרה הקרובה ביותר לקצה הצלחת בשעה 12 ועוד 3 טיפות בשעה 6. ודא שהמרווח בין הטיפות דומה.
- מניחים 3 טיפות של 10 μl של טעם ניסיוני הקרוב ביותר לקצה הצלחת בשעה 3 ועוד 3 טיפות בשעה 9. ודא שהמרווח בין הטיפות דומה.
- חזור על שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2 עבור מספר עותקים משוכפלים כרצונך.
- רוקן בקבוקון אחד של ~ 100 זבובים מורעבים על כרית CO2 מספיק זמן כדי להרדים את כל בעלי החיים (כ -10 שניות). מברישים את החיות לאמצע תא בדיקה מוכן ומכסים במכסה הכלים.
NOTE: יש להימנע מתקופות ארוכות יותר של חשיפה ל-CO2 כדי לשפר את זמן ההתאוששות ולהגביל את ההפרעה להתנהגות ההאכלה. חשיפה לקרח (~ 5 דקות) עשויה לשמש להרדמה כדי למנוע השפעות התנהגותיות של CO2 שעלולות לנבוע אפילו מחשיפה מוגבלת.
- הניחו את תא הבדיקה בקופסת קרטון אטומה. הקפד לתייג את החלק החיצוני של הקופסה עם המצב והגנוטיפ הנבדק.
- מקם את כל ההתקנה (תא הבדיקה הכלול בתוך קופסת קרטון משלב 2.4) לתוך אינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם לפחות 70% לחות למשך שעתיים.
- חזור על שלבים 2.3 עד 2.5 עבור כל הפריטים המשוכפלים.
- לאחר שעתיים, הניחו את תאי הבדיקה, שעדיין נמצאים בתוך קופסאות קרטון, ישירות למקפיא בטמפרטורה של -20°C עד שיהיו מוכנים לכימות.
3. כימות מבחן העדפות טעם
- אפשר לתא בדיקה יחיד להתחמם לטמפרטורת החדר (כ-5 דקות).
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, באמצעות מברשת או זוג מלקחיים, מקבצים חיות לפי צבע הבטן שלהן: אדום, כחול, סגול או שקוף (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1).
- רשום את מספר בעלי החיים בכל קבוצה. קחו בחשבון בעלי חיים ברורים שלא השתתפו בבדיקה ולכן אל תכללו אותם בחישובים כלשהם.
- חישוב מדד ההעדפות לפי אחת מהמשוואות הבאות:
- אם מוסיפים את הטעם הניסיוני של העניין לצבע האדום, השתמש (Nאדום + 0.5Nסגול) / (Nאדום + Nכחול + Nסגול).
- אם מוסיפים את הטעם הניסיוני לצבע הכחול, התאם את המשוואה ל- (Nכחול + 0.5Nסגול)/(Nכחול + Nאדום + Nסגול).
- חזור על החישובים עבור כל תנאי הניסוי והשכפולים.
4. אופטימיזציה של בדיקת העדפות טעם
- לקבוע אמפירית את ריכוז מדדי צבעי המאכל שישמשו כך שצבעי מאכל לא ישפיעו על תוצאת בדיקת הטעם, כדלקמן:
- הכינו 4 טעימות מאותה תרכובת בסיס (למשל 5 מ"מ סוכרוז) כפי שמצוין בשלב 2.1, אך השמיטו את צבעי המאכל.
- הוסיפו 1.3% צבעי מאכל אדומים לאחד הטעמים. הכינו את 3 הטעמים הנותרים עם צבעי מאכל כחולים בריכוזים משתנים בכל צינור (למשל 0.6%, 1% ו-1.3%).
- פרוטוקול מלא שלבים 2.2 עד 3.4 עבור כל זוג טעים: 1.3% אדום לעומת 0.6% כחול; 1.3% אדום לעומת 1% כחול ו-1.3% אדום לעומת 1.3% כחול.
- חזור על שלב 4.1.1-4.1.3 עם אחוזים שונים של צבעי מאכל כחולים עד שמדד ההעדפות יקבל ערך ממוצע של 0 (איור 2).
NOTE: כנקודת התחלה, 1.3% צבעי מאכל אדומים בשילוב עם 1% צבעי מאכל כחולים בדרך כלל מניבים תוצאות טובות. אם לא ניתן להתאים ריכוז משביע רצון של צבעי מאכל כחולים ל-1.3% צבע, ניתן לחזור על שלב 4.1.1 עד 4.1.3 עם ריכוזים משתנים של צבע אדום וריכוז קבוע של צבעי מאכל כחולים.
- יש לנתח את כל התנאים שיש לבדוק עם אותם ריכוזי צבעי מאכל אופטימליים.
