בדיקת CApillary FEeder (CAFE): שיטה למעקב אחר צריכת מזון והעדפתו בדרוזופילה

תקציר

מקור: Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay מודד צריכת מזון במלנוגסטר דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את CApillary FEeder, או CAFE, assay, שיטה התנהגותית המודדת צריכת מזון והעדפה של זבובי פירות בלתי מרוסנים. הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לבצע את הבדיקה עם אידוי מינימלי מהנימים המלאים בנוזל המשמשים להעברת המזון ולעקוב אחר צריכתו.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. הרכבה וביצוע של בדיקת FEeder

1. אם אין צורך בצום, העבירו את זבובי הניסוי לבדיקה על ידי הקשה או על ידי צינור נשיפה. הקפידו לכלול שלושה בקבוקוני בקרה ללא זבובים כדי לכמת את האידוי.
2. מוציאים בזהירות קצה פיפטה (2 - 20 מיקרוליטר נפח) שסוגר את אחד הפתחים החיצוניים, ומכניסים תחילה נימי זכוכית מלאים, בקצה התחתון. אבטחו את הנימים על ידי הנחת קצה הפיפטה בחזרה ליד הנימים. אם נבדקים מספר פתרונות מזון, חזור על הליך זה בהתאם.
3. מניחים את קצוות הנימים בתוך כל הבקבוקונים באותה רמה כדי למנוע הטיה שעלולה להתרחש אם מקורות המזון היו ממוקמים בגבהים שונים (3 - 4 ס"מ מהמכסה); שמור מרחק לנייר הסינון כדי למנוע מהנימים לדלוף על ידי נגיעה בטעות בנייר הסינון או צמיגויות שונות של מקורות מזון.
4. תייג את הקצה העליון של הנוזל הצבעוני באמצעות עט סמן (סמן_התחלה). כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות את הנימים השונים, תייגו אותם בנפרד באמצעות קוד צבע או פס.
5. הניחו מבחני CAFE מוכנים מרובים בתוך קופסת פלסטיק עם שיבוץ מרושת והעבירו את הקופסה (איור 2A) למצב בטוח בתנאי מעבדה או בתא אקלים מבוקר טמפרטורה, אור ולחות (פרמטרים: 25°C, 60% לחות יחסית, 12 שעות/12 שעות מחזור אור-חושך) לתקופת הניסוי (למשל 3 שעות או ימים).
6. מכיוון שנייר המסנן התחתון מתייבש אם הבדיקה מבוצעת במשך מספר ימים, יש למרוח מים מתוקים כל 24 שעות דרך באנג הספוג (100 מיקרוליטר) כדי לשמור על לחות קבועה בתוך הבדיקה. השתמש בארבעה בקבוקונים נפרדים (8 ס"מ גובה, 3.3 ס"מ קוטר) מלאים 30 מ"ל ddH₂O כמכשירי לחות והנח אותם ליד מבחני CAFE בקופסת הפלסטיק. השתמשו בכיסוי לקופסת הפלסטיק כדי ליצור סביבה מבוקרת לחות במהלך הניסוי (איור 2A).
   NOTE: שונות רחבה יותר מתרחשת בתנאי מעבדה; עם זאת, ניתן לבצע את בדיקת CAFE בטמפרטורת החדר (למשל, בכיתה). מומלץ מאוד להשתמש במכשיר לחות (נייר סינון, עם או בלי באנג ספוג רטוב, בקבוקוני מים מלאים וכיסוי לקופסת הפלסטיק) כדי להפחית את האידוי (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2B).
7. החליפו את הנימים בנימים ממולאים טריים לניסויים ארוכי טווח כל 24 שעות. שימו לב לזבובים מתים לפני כל מרווח של 24 שעות והשתמשו במספר הזבובים החיים כדי לחשב את הצריכה לכל זבוב לתקופה הבאה. השליכו את הנימים הישנים לאחר מדידת שקיעת המניסקוס (ראו 2.1).
   NOTE: במהלך ניסוי של 3 שעות אנו בקושי רואים זבובים מתים. במהלך מחקר של 4 ימים אנו מוצאים בדרך כלל 1 - 3 זבובים מתים.
8. בסוף הבדיקה או לפני החלפת הנימים, סמן את המניסקוס התחתון של הנימים (_קצה הסימון) בעט טוש כאשר בדיקת CAFE עדיין במצב זקוף. מחק את הנתונים אם_סוף הסימון אינו נמוך מהסימן הראשוני (סמן_התחלה). אין להסיר את המכסה, שכן הדבר עלול לשנות את המניסקוס.
9. בזהירות להסיר את נימים מן הבדיקה ולאחסן אותם לאיסוף נתונים. בדוק אם הנוזל בתוך הנימים הגיע לקצה התחתון אם לא להשליך את הנתונים, מכיוון שהמזון לא היה נגיש לזבובים. אספו את כל הנימים לכל בקבוקון כקבוצה. הכניסו קצוות פיפטה לא חתוכים לכל הפתחים כדי למנוע בריחה של זבובים. יש לפרק את ההתקנה ולשטוף את הבקבוקונים, המכסים ובאנגי הספוג באמבט סבון ולייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר לשימוש נוסף.
   NOTE: זבובים ניתן לנתח עוד יותר לאחר הבדיקה. יש לאשר ספיגת מזון בעין או תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
10. חזרו על ניסויים עם אותם גנוטיפים לפחות בשלושה ימים שונים.

2. איסוף וניתוח נתונים

1. מדוד את המרחק בין_{סימן התחלה וסוף} סימון על הנימים באמצעות קליפר או סרגל. כדי להעביר נתונים ישירות לגיליון אלקטרוני, השתמש בקליפר דיגיטלי המחובר באמצעות USB (אפיק טורי אוניברסלי) (איור 1E). השליכו את הנימים לאחר המדידה.
2. קחו בחשבון את גודל הנימים כדי לחשב ספיגה או אידוי של מזון. לדוגמה, שקול נימי שאורכו 73 מ"מ והוא מכיל 5 מיקרוליטר של תמיסת מזון. ירידה של 14.6 מ"מ במיניסקוס משקפת ספיגה של תמיסת 1 μL. חשב את צריכת המזון באמצעות הנוסחה הבאה:
   ספיגת מזון (μL) = מרחק נמדד (מ"מ)/ 14.6 מ"מ
3. כדי לא לכלול את השפעת האידוי על צריכת המזון, חשב אידוי ממוצע בשלושת בקבוקוני הבקרה (לכל הפחות) ללא זבובים. הפחת ערך ממוצע זה מהערך המתקבל לצריכת מזון על ידי הזבובים.
4. השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע את הצריכה הכוללת לכל זבוב:
   צריכת מזון (μL) = (ספיגת מזון [μL] - אובדן אידוי [μL])/המספר הכולל של זבובים בבקבוקון. עבור ניסויים ארוכי טווח, השתמש במספר הזבובים החיים לפני תחילת מרווח של 24 שעות.
5. כדי להסביר הבדלים בגודל הגוף, כגון בין זבובים זכרים ונקבות, נרמלו את צריכת המזון למשקל הגוף (μL מזון/מ"ג זבוב).
6. השתמש בתוכנה סטטיסטית לניתוח נתונים. עבור נתונים המופצים בדרך כלל, השתמש במבחני T של התלמידים כדי לקבוע הבדלים בין שתי קבוצות זבובים, והשתמש ANOVA (ניתוח שונות) עם מבחני Tukey Cramer פוסט הוק עבור יותר משתי קבוצות. במצב בחירה, נתח הבדלים מבחירה אקראית באמצעות מבחן סימן חד מדגמי לא פרמטרי.

תוצאות

איור 1: בדיקת דרוזופילה מלנוגסטר (Drosophila melanogaster CApillary FEeder Assay). א) בדיקת האכלה עם זבובים. נייר פילטר לח מספק מים בתחתית הבקבוקון. ארבעה נימים מסופקים במהלך הניסוי (מזון בצבע אדום וכחול בנימים מנוגדים). שימו לב שהנימים מאובטחים במקומם על ידי קצה פיפטה שני, ועמדות שאינן בשימוש נסגרות באמצעות קצות פיפטה. תקע קצף במרכז המכסה מאפשר החלפת אוויר. ב) תצוגה מפורטת של ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוקונים (רבייה)	גריינר ביו-וואן	960177	www.greinerbioone.com
בקבוקונים (CAFE assay)	גריינר ביו-וואן	217101	www.greinerbioone.com
בדיקת Lid-CAFE	סדנת	–	–
קופסת פלסטיק, דופן נמוכה	פלסטיים	353	www.plastime.it
כיסוי לקופסת הפלסטיק	סדנת	–	–
נימים	בלאוברנד	REF 7087 07	www.brand.de
טיפים לפיפטה	גריינר ביו-וואן	771290	www.greinerbioone.com
סינון מעגלי נייר	מה איש	10,311,804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-סוכרוז	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
אתנול מוחלט	VWR כימיקלים	20,821,330	www.vwr.com
צבע מאכל (אדום, E124)	באקפאן	10027	www.backfun.de
צבע מאכל (כחול, E133)	באקפאן	10030	www.backfun.de
תמיסת סבון (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
קליפר דיגיטלי	גרנט	412,616	www.hoffmann-group.com
בקבוקונים (רבייה)			גובה 9.8 ס"מ, קוטר 4.8 ס"מ
בקבוקונים (CAFE assay)			גובה 8 ס"מ, קוטר 3.3 ס"מ
בדיקת Lid-CAFE			הופק בסדנה אוניברסיטאית, שרטוט טכני מסופק אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קופסת פלסטיק, דופן נמוכה			שיבוץ רשת פלסטיק נעשה בהתאמה אישית עבור 8 x 10 עמדות בקבוקון
כיסוי לקופסת הפלסטיק			מידות (37 x 29 x 18 ס"מ)
נימים			DIN ISO 7550 נורמה, IVD-הנחיה 98/79 EG, מסתיים מלוטש
טיפים לפיפטה			פיפטות עבור המעגל החיצוני נחתכים על פי המכסה
סינון מעגלי נייר			קוטר 45 מ"מ עובד יפה אם מקפלים אותו לבקבוקונים שבהם נעשה שימוש
D(+)-סוכרוז			לא מזיק
אתנול מוחלט			נוזל ואדים דליקים במיוחד
צבע מאכל (אדום, E124)			לא נאמר
צבע מאכל (כחול, E133)			לא נאמר
תמיסת סבון (CVK 8)			סבון ניטרלי ריח
קליפר דיגיטלי
אוכל זבוב סטנדרטי			(ל-20 ליטר)
אגר			160 גרם
שמרי בירה			299.33 גרם
קמח תירס			1,200 גרם
דבשה			1.6 ליטר
חומצה פרופיונית			57.3 מ"ל
Nipagin 30%			160 מ"ל