הכנת פילה זחל: שיטה לדמיין נוירונים חושיים שלמים ותאי אפידרמיס הקשורים

תקציר

מקור: Tenenbaum, C. M., Gavis, E. R. הסרת רקמת שריר דרוזופילה מפילה הזחל לניתוח אימונופלואורסנציה של נוירונים חושיים ותאי אפידרמיס. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר כיצד להכין פילה זחל המשמש להדמיה של נוירונים דנדריטיים חושיים (DA) ותאי האפידרמיס הקשורים אליהם. הפרוטוקול המוצג מראה בפירוט כיצד להסיר רקמת שריר מדופן הגוף תוך שמירה על המורפולוגיה של התאים, מה שמשפר את ההדבקה החיסונית וההדמיה של תאי העצב ותאי האפידרמיס המוסתרים אחרת.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Tenenbaum and Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp.(2016).

הערה: הליך הסרת השרירים (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילה זחל. השלבים הקודמים להסרת השרירים ולאחריהם מתוארים בקצרה והקורא מופנה לעבודה קודמת ב- Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) ו- Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011) לתיאורים מפורטים יותר.

1. לנתח זחלים במי מלח קרים

1. הכינו דילול עובד של מי מלח קרים מסוג HL3.1 או מלוחים קרים ללא Ca²⁺ (טבלה 1). מניחים את הזחל בכלי אלסטומר סיליקון עם מספיק מלח קר כדי לכסות את תחתית המנה.
   NOTE: אנו ממליצים להתנסות בשימוש במי מלח HL3.1 ללא Ca²⁺ לעומת מי מלח סטנדרטיים מסוג HL3.1 במהלך דיסקציה של הזחל. בהיעדר סידן, התכווצויות שרירי הזחל מופחתות מאוד. לכן, פילה הזחל עשוי להיות קל יותר למניפולציה כאשר הוא מנותח במי מלח ללא Ca²⁺ HL3.1. עם זאת, אנו מוצאים כי התכווצות שרירים יוצרת רווח בין השריר לאפידרמיס וזה יכול להקל על החדרת מלקחיים בין רקמות אלה תוך מזעור הסיכון לנזק לאפידרמיס. כתוצאה מכך, תקן HL3.1 עשוי להיות עדיף לשמירה על שלמות האפידרמיס ותאי העצב. אנו משיגים תוצאות טובות עם מי מלח והבחירה נשארת למשתמש.
2. מקם את הזחל עם הצד הגחוני כלפי מעלה. ניתן לזהות את המשטח הגחוני של הזחל על ידי חגורות הבטן הזהות ואת הצד הגבי על ידי צינורות קנה הנשימה העיקריים של הזחל העוברים מהקדמי לאחורי. מותחים את הזחל בכיוון הקדמי-אחורי ומצמידים את הראש והזנב לצלחת חיתוך אלסטומר סיליקון באמצעות סיכות חרקים. השתמש במספריים מנתחים עדינים כדי לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני, מתחיל בקצה אחד ומתקדם לכיוון השני.
   NOTE: כיוון זה משמר את הצביר הגבי הנחקר בדרך כלל של נוירוני דה.
3. לאחר שהזחל נחתך, הצמידו את ארבע הפינות לצלחת הניתוח כאילו פתחו ספר. השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים, כולל CNS, מעיים, קנה הנשימה. התאימו את סיכות החרקים כך שהפילה יהיה מתוח אך לא מתוח באופן מקסימלי.
   NOTE: השרירים מעוגנים לדופן הגוף בגבולות סגמנטאליים. למרות שהשרירים מכסים את רוב דופן הגוף, הם נעדרים באזור צר ליד קו האמצע הגבי.

2. הסרת שרירים

1. אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת שריר נעדרת. מקמו מלקחיים בודדת כך שניתן יהיה להחדירה אותה מתחת לרקמת השריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי.
2. מתחילים מקו האמצע הגבי, קרוב לגבול הקדמי של הקטע, מחליקים בזהירות את המלקחיים בין השריר לאפידרמיס, תוך הקפדה על מזעור המגע בין המלקחיים לאפידרמיס.
3. משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר לדופן הגוף בנקודת עיגון אחת. חזור על תהליך זה עבור חצי הקטע הנותרים של עניין.
   NOTE: פרוטוקול זה מייעל את שימור החלק האחורי של כל שדה דנדריט נוירון. כדי לשמר את החלק הקדמי של שדה הדנדריט, עדיף להכניס את המלקחיים בקצה האחורי של כל קטע.
4. התאימו מחדש את סיכות החרקים כך שפילה הזחל יימתח באופן מקסימלי לכל הכיוונים.
5. תקנו את הפילה בעודו מוצמד לצלחת הניתוח בעזרת פורמלדהיד קר וטרי 4% ב-PBS למשך 25 דקות.
6. יש לשטוף 5 פעמים ב-PBS.
7. השתמש במלקחיים כדי למשוך בזהירות את רקמת השריר מנקודות העוגן הנותרות, תוך הקפדה על מזעור המגע עם האפידרמיס.
8. מוציאים את הפילה מצלחת הניתוח לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. בצע את כל שלבי השטיפה, החסימה והצביעה האימונופלואורסצנטית הבאים, כפי שתואר קודם לכן ב- Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011).

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של הליך הסרת שרירים. זחל מנותח ומוצמד לצלחת ניתוח אלסטומר סיליקון. כדי להסיר רקמת שריר, מלקחיים אחד מוכנס בין שכבת השריר לשכבת תאי האפידרמיס, החל מקו האמצע הגבי ליד גבול קטע (2.2). המלקחיים נמשכים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור בין השריר לדופן הגוף (2.3). זה חוזר על עצמו עבור קטעי עניין ולאחר מכן הזחל קבוע פורמלין (2.5). לאחר הקיבוע, מלקחיים משמשים להפרדת רקמת השריר הנותרת מדופן הגוף (2.7 - 2.8) הקוטיק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פינצטה Dumont #5	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72701-ד
מספריים מיקרו, 8 ס"מ, ישר, להבים 5 מ"מ, קצוות 0.1 מ"מ	מכשירים מדויקים בעולם	14003
ערכת אלסטומרים סיליקון Sylgard 184	דאו קורנינג	3097358-1004	לניתוח צלחות
סיכות חרק אוסטרליץ, 0.1 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	26002-10
מקור אור Fostec 8375	קבוצת טכנולוגיה ארטיזנלית	62792-4