פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Reimels and Pfleger, Methods to Examine the Lymph בלוטת והמוציטים בזחלי דרוזופילה, J. Vis. Exp. (2016).
1. זחל בלוטת הלימפה אימונוהיסטוכימיה
הערה: בלוטת הלימפה ממוקמת כשליש אורך מהקצה הקדמי של הזחל מעט מתחת למוח בצד הגבי. (ראו חץ באיור 1B.) בלוטת הלימפה מאגפת את כלי הדם הגבי וניתן לנתח אותה בקלות רבה כשהיא מחוברת לווי הפה או למוח. בלוטות לימפה מסוג פראי, שלישי instar הם מבנים קטנים מאוד; אורך האונות הראשוניות הוא כ-100 - 200 מיקרומטר. (ראו איור 2A.)
- כדי להשיג זחלים בערך באותו שלב התפתחותי עבור בדיקה זו, להגביל את איסוף הביצים על ידי מתן אפשרות לנקבות להטיל ביצים לתקופה קבועה של 2 - 6 שעות.
- דיסקציה של בלוטת הלימפה
- עבור כל תנאי ניסוי, הוסף 1 מ"ל 1x PBS (טבלה 1) לבאר אחת של צלחת 24 בארות.
- הוסף טיפה אחת של 0.1% PBST (טבלה 1) לכל באר באמצעות pipet.
NOTE: חומר ניקוי, כגון Tween 20, מתווסף כדי להוריד את מתח פני השטח, ומאפשר לרקמה לשקוע לתחתית הבאר.
- מניחים את הצלחת שטוחה על קרח.
- לאסוף זחלים בבארות צלחת לנתח מלא 1x PBS.
- הניחו משטח ניתוח נקי על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר. השתמשו בצינור העברה חד-פעמי כדי להניח טיפות קטנות של 0.01% PBST (טבלה 1) על הפד. מעבירים זחל אחד לטיפת PBST לנתיחה.
- החזיקו את הזחל עם זוג מלקחיים אחד באורך של כרבע מהקצה האחורי, הצד הגבי כלפי מעלה.
- השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס את הקוטיקולה מיד לפני המלקחיים המחזיקים את הזחל. משכו בעדינות את הקוטיקולה לכיוון הקצה הקדמי עד שקרסי הפה נחשפים.
NOTE: המטרה היא לקלף את הקוטיקולה מבלי להפריע למבנים פנימיים.
- שחררו את הקוטיקולה והשתמשו בשתי המלקחיים כדי לחתוך את הזחל לשניים. הסר את הקצה האחורי מטיפת PBST.
NOTE: אם הקוטיקולה אינה מתקלפת עד קרסי הפה, חותכים את הזחל לשניים ומסירים את הקצה האחורי. השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את קצה הקוטיקולה, והשתמש בזוג המלקחיים השני כדי לדחוף את ווי הפה דרך הפתח. פעולה זו תהפוך את הקוטיקולה ותחשוף את ווי הפה. זה יכול לשמש גם כשיטת דיסקציה חלופית.
- השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להצמיד את הקוטיקולה (הקוטיקולה הגחון, דש הקוטיקולה הגבית, או שניהם) ליציבות.
- השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לתפוס את ווי הפה החשופים ולמשוך אותם בעדינות החוצה.
NOTE: זה יפריד את הקוטיקולה מהמבנים הפנימיים. באופן אידיאלי, הדיסקים הדמיוניים של העין/אנטנה, המוח, בלוטת הטבעת, ובלוטת הלימפה הצמודים לכלי הדם הגבי יישארו מחוברים לווי הפה.
- בעודכם עדיין מחזיקים את ווי הפה, הסירו בזהירות מבנים לא רצויים כגון בלוטות הרוק, גוף השומן והמעי.
NOTE: אם המוח נפרד מקרסי הפה, בלוטת הלימפה עדיין עשויה להיות מחוברת למוח ונאספת איתו. במקרה זה, החזק את חוט העצב הגחוני במקום את ווי הפה.
- באמצעות ווים הפה או חוט עצב הגחון כמו ידית, להעביר את המתחם מנותח המכיל את בלוטת הלימפה אל הבאר על קרח. אין לחרוג מ-30 דקות לפני הקיבוע.
- קיבוע ואימונוהיסטוכימיה
- הניחו את הצלחת בעלת 24 הבארות על בסיס הסטריאומיקרוסקופ.
- השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBST מן הבאר.
NOTE: בארות שכנות ריקות שימושיות להפקדה זמנית של פסולת.
- הוסיפו בעדינות 200 μl 3.7% פורמלדהיד (טבלה 1) במורד דופן הבאר וסובבו את הצלחת כדי להבטיח שהרקמות המנותחות שקועות לחלוטין.
- מחזירים את הצלחת לקרח למשך 30 דקות. אם בלוטות הלימפה מבטאות חלבונים פלואורסצנטיים, יש לשמור על הצלחת מכוסה כדי למנוע הלבנה
.
- השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את הקיבוע.
- שטפו על ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר והנחת הצלחת על שייקר אורביטלי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBS.
NOTE: בלוטות לימפה קבועות ניתן להשאיר על קרח PBS עד בלוטות הלימפה עבור כל התנאים הניסיוניים מנותחים וקבועים.
- חזרו על שלבי הכביסה פעמיים נוספות.
- הוסף תמיסת חלחול של 200 μl (טבלה 1) לבאר. הניחו את הצלחת על שייקר מסלול למשך 45 דקות ב-RT.
הערה: 45 דקות הוא "תקן הזהב" לחדירות בלוטת הלימפה, אך המחברים זוכים להצלחה לאחר 20 דקות בלבד.
- הסר את הפתרון עם פיפטה p200.
- לדלל נוגדן ראשוני בתמיסת נוגדנים (טבלה 1) בהתאם למפרט הספק. הוסף תמיסת נוגדנים ראשונית של 300 μl לבאר וודא שהרקמות המנותחות שקועות לחלוטין. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- השתמש פיפטה p200 כדי להסיר את הנוגדן הראשי.
- שטפו על ידי הוספת 200 μl 1x PBS לבאר והנחת הצלחת על שייקר מסלול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש פיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את PBS.
- חזרו על שלבי הכביסה פעמיים נוספות.
- לדלל נוגדנים משניים בתמיסת נוגדנים בהתאם למפרט הספק. הוסף 300 μl תמיסת נוגדנים משנית לבאר וודא כי הרקמות מנותחות שקועות לחלוטין. יש לדגור על שייקר מסלול למשך שעתיים לפחות ב-RT.
- השתמש פיפטה p200 כדי להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף כמתואר בשלבים 1.3.12 ו- 1.3.13. אין להסיר את ה-PBS לאחר השטיפה הסופית.
- הרכבה של בלוטת הלימפה
- שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נקיות באמצעות אתנול 70% (טבלה 1) ומגבוני רקמות.
- עבור כל תנאי ניסוי, הניחו טיפה אחת של חיץ הרכבה (טבלה 1) על שקופית הזכוכית.
NOTE: שני תנאים מתאימים לשקופית אחת. נפח חיץ ההרכבה תלוי במספר בלוטות הלימפה שיש להתקין. יש להשתמש ב-2 μl עבור כ-18-20 בלוטות לימפה, 1 μl עבור 10-12 ו-0.5 μl עבור 5 או פחות.
- הניחו את שקופית המיקרוסקופ על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר.
- עבור עד שני מצבים בכל פעם, להעביר את כל בלוטות הלימפה מן הבאר אל חיץ הרכבה עם מלקחיים, באמצעות ווים הפה או חוט עצב הגחון כמו ידית.
- רווח את הרקמות המנותחות באופן שווה בצורה מעגלית או מלבנית, ופיזר את מאגר ההרכבה בתהליך.
- עבור כל אחת מהרקמות המנותחות, בנפרד, החליקו טונג אחד של המלקחיים מתחת לכלי הדם הגבי ומשכו בעדינות לכיוון הפריפריה של חיץ ההרכבה.
NOTE: פעולה זו תמשוך את בלוטת הלימפה משאר הרקמות המנותחות ותשטח את בלוטת הלימפה על הזכוכית.
- בעזרת טונג אחד של המלקחיים ותנועת ניסור, חתכו את כלי הדם הגבי בין בלוטת הלימפה למוח.
- העבר את שאר הרקמות המנותחות לצד הנגדי של בלוטת הלימפה, בקצה החיצוני ביותר של החיץ.
NOTE: הרקמות המנותחות הלא רצויות יהוו בסופו של דבר היקף סביב בלוטות הלימפה וישמשו כתמיכה שעליה יישען הכיסוי.
- חזור על הפעולה עד שכל בלוטות הלימפה מופרדות מהרקמות המנותחות, ושומר את אחת הרקמות המנותחות הלא רצויות למקם במרכז.
- קח כיסוי בין שתי אצבעות. בדקו שהכיסוי נקי מאבק וטביעות אצבע. במידת הצורך, השתמש במגבון טישו ואתנול 70% כדי לנקות את הכיסוי.
- כדי לוודא שקצה הכיסוי מקביל לקצה מגלשת הזכוכית, הנמיכו בזהירות את הכיסוי מעל מאגר ההרכבה.
NOTE: ניתן לאחסן שקופיות מיקרוסקופ בטמפרטורה של 4°C לפני ההדמיה. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות הנוגדנים המשמשים. צלחות 24 בארות ניתן לשטוף ולעשות שימוש חוזר.
2. הדמיה
- תמונה המוציטים קבועים ובלוטות לימפה רכובות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי מתאים או קונפוקלי בהגדלה של פי 20 ומעלה בהתאם למדריך ההפעלה של היצרן. צלם זחלים שלמים על סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי בהגדלה פי 2 בהתאם למדריך ההפעלה של היצרן.
- בצע את ההוראות של ספק התוכנה עבור deconvolution, אם תרצה.
