פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).
1. הכנת תחנת דיסקציה
- מקמו את הסטריאומיקרוסקופ ואת מקור האור בעזרת צוואר אווז סיב אופטי מחובר על ספסל גדול. כדי לקדם תנועות ידיים יציבות ולהפחית את "לחיצת היד" בזמן הניתוח, חיוני שיהיה מקום מספיק למשענת היד והזרוע סביב המיקרוסקופ. ודא שיש בערך 8 - 10 אינץ 'משני צדי המיקרוסקופ ו 4 - 6 אינץ 'בין בסיס המיקרוסקופ לקצה הספסל.
- מלא 2 או 3 בארות של צלחת זכוכית 9 בארות או 3 בארות עם 1.0 מ"ל של חיץ PTN (0.1 M נתרן פוספט חיץ pH 7.2, 0.1% פעילי שטח nonionic, ראה טבלת חומרים עבור רכיבי חיץ מלאים) ומניחים ליד תחנת הניתוח על קרח. מוחות חדשים שנותחו יועברו לצלחת זו ויאוחסנו עד לשלב הקיבוע.
NOTE: אם נדרשת הדמיה חיה, מאגר הדיסקציה צריך להיות 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) או HL3 buffer. אם נדרשת לוקליזציה של חלבונים תוך תאיים, PBS יכול לשמש גם כחיץ חלופי לדיסקציה וקיבוע. לאחר הקיבוע, יש לבצע חדירה של קרום התא באמצעות שטיפות PTN המכילות 0.1% או 0.3% חומר ניקוי לא יוני.
- אם PBS משמש לדיסקציה וקיבוע, יש לשטוף את קצות פיפטה לפחות פעם אחת עם חיץ המכיל חומר ניקוי (כגון PTN) כדי למנוע מהמוח להידבק לקצות פיפטות הפלסטיק במהלך ההעברה לצינורות מיקרוצנטריפוגה.
- בעזרת צלחת פטרי ריקה בקוטר 35 מ"מ מזכוכית או פלסטיק, בונים צלחת דיסקציה המכילה אלסטומר סיליקון. בקצרה, מערבבים את רכיבי האלסטומר בהתאם להוראות היצרן, יוצקים לתוך כלים 35 מ"מ, ולתת לו להתפלמר לילה על משטח שטוח. יש להשתמש באלסטומר המכיל כלי דיסקציה כדי להגן על הקצוות העדינים של מלקחיים מנתחים, אשר יכולים להיפגע בקלות אם נוצר מגע בין המלקחיים לבין משטח קשה יותר, כגון צלחת זכוכית. אנו גם רוכשים באופן קבוע כלים מצופים סיליקון זמינים מסחרית מקמעונאים מקוונים. כדי להגביר את הניגודיות במהלך נתיחות, כלים לדיסקציה של אלסטומרים מסיליקון המכילים פחם מומת (ולכן צבועים בשחור) שימושיים במיוחד.
2. הליך דיסקציה מוחית למבוגרים
- להרדים 3 - 5 ימים מבוגר D. melanogaster עם CO2 או באמצעות קרח. אם אתם משתמשים בקרח, הניחו את הבקבוקון המכיל זבובים הפוך (קצה התקע כלפי מטה) לתוך דלי קרח למשך ~5 דקות. הנחת הבקבוקון במהופך מונעת מזבובים להיתקע במזון. לאחר שהזבובים הורדמו, הניחו את הזבובים על משטח מתכת קר או צלחת פטרי היושבים בקרח או על משטח זבובים פולט CO2. אם מנתחים מוחות כדי לנתח ניוון עצבי, ניתן להשתמש גם בזבובים מבוגרים יותר.
- מניחים כמות קטנה (150 - 200 μL) של PTN במרכז צלחת הדיסקציה באמצעות פיפטת העברה או פיפטה p200 כדי ליצור "בועה" של PTN. הניחו את צלחת הדיסקציה מתחת לסטריאומיקרוסקופ והתאימו את התאורה והמיקוד כך שהבועה של PTN תמלא את שדה הראייה ותהיה מוארת באופן אחיד.
- תמרן זבובים כך שהם יהיו "בטן למעלה" (כלומר, צד הגחון כלפי מעלה) בזמן שהם שוכבים על כרית מתכת או CO2.
- באמצעות זוג אחד של #5 מלקחיים, לתפוס את הבטן של זבוב להיות מנותח, שמירה על אחיזה של הזבוב, לחלוטין לטבול אותו PTN על צלחת דיסקציה.
NOTE: עבור שאר הפרוטוקול, יש לבצע את כל השלבים בזמן שהראש שקוע ב- PTN.
- באמצעות זוג שני של #5 מלקחיים, לתפוס את הבסיס של חוטם הזבוב ולמשוך את שני זוגות המלקחיים בנפרד כדי לנתק את ראש הזבוב מהגוף. השליכו את הבטן ואת בית החזה. במהלך שלב זה, זה קריטי כי הראש אינו משוחרר ומותר לצוף על פני השטח של PTN. ברגע שהראש צף, זה יכול להיות קשה מאוד לתפוס שוב מבלי למחוץ את המוח.
NOTE: בשיטה זו מנתקים הקשרים בין המוח לחוט העצב הגחוני. אם נדרשים חיבורים שלמים בין אזורים אלה של מערכת העצבים המרכזית, יש לעקוב אחר פרוטוקול דיסקציה חלופי. אם החוטם מתנתק מראש הזבוב לפני הסרת הראש, יהיה חור במקום שבו היה החוטם. במקרה זה, לתפוס את ראש הזבוב בקצה החור ליד עין אחת. לאחר מכן הסר את הראש באמצעות כמות מתונה של כוח תוך משיכת שני זוגות המלקחיים זה מזה. לעיתים, כאשר מוציאים את הראש מהגוף, המעי ו/או חוט עצב הגחון נשארים מחוברים לראש ויש להסירם לפני המשך הנתיחה.
- בעוד זוג אחד של מלקחיים אוחז את proboscis, הזוג השני צריך לתפוס את הקצה המדיאלי של עין הזבוב הימנית. לאט לאט, מפרידים את המלקחיים זה מזה. שלב זה צריך להתבצע עם כמות קטנה של כוח רוחבי יציב. כאשר המלקחיים מתרחקים לאט זה מזה, החוטם צריך להתרחק מהראש וליצור חור מרכזי בקוטיקולה של הראש. יש להשליך את החוטם עם זוג המלקחיים הראשון מבלי לשחרר את החלק המדיאלי של עין ימין מהזוג השני.
NOTE: המוח הבוגר של D. melanogaster נמצא באזור הקאודלי (כלומר, האחורי/אחורי) של ראש הזבוב. לכן, יש להימנע מאחיזה באזור זה של הראש. באופן אידיאלי, רק החלק הרוסטרלי (כלומר, הקדמי) של הראש ליד הרשתית המדיאלית צריך להיתפס ישירות על ידי המלקחיים. המוח וקנה הנשימה הקשור אליו אמורים כעת להיראות דרך החור המרכזי בקוטיקולה. בשלב זה, כל חוטים לבנים מחוטבים של קנה הנשימה בולט מן החור ניתן להסיר ולהשליך.
- בעזרת זוג המלקחיים השני, אחזו בקצה המדיאלי של הרשתית השמאלית (בקצה החור המרכזי בקוטיקולה של הראש). כדי להסיר את הרשתית ואת הקוטיקולה הקשורה, משכו באיטיות את המלקחיים זה מזה בזווית של 180°. כאשר הרשתית מתנתקת מהאונה האופטית הבסיסית, אתה אמור להרגיש ירידה קלה במתח. המשך לאט כדי למנוע קריעה של האונה הראייתית.
NOTE: הפרדת המלקחיים מהר מדי בשלב זה עלולה לגרום לקריעה של האונה האופטית או להפרעה במבני גוף הפטריות. לעיתים, הקוטיקולה תוסר אך חלקים מהרשתית יישארו מחוברים לאונה האופטית. אם מדמים את גופי הפטריות, אין צורך לחלוטין להסיר את הרשתית כולה. עם זאת, ניתוח של אזורי מוח אחרים (כגון עצבוב נוירוני הרשתית של אונות המוח הראייה) עשוי לדרוש הסרה מלאה של הרשתית כמתואר על ידי.
NOTE: מכיוון שהרשתית מופרדת לאט מהאונה האופטית הבסיסית של המוח, האונה האופטית צריכה להיות נצפית כמבנה לבן אטום המכוסה בקנה נשימה לבן ומחוטב. לאחר הסרת רשתית אחת, ניתן להשליכה אותה. בעת ניתוח pathfinding של נוירונים ברשתית, יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך שלב זה כדי למנוע נזק לאונה הראייתית. פרוטוקול נוסף המתמקד בדיסקציה והדמיה חיה של נוירוני קולטני האור זמין גם כן.
- עכשיו, בזהירות להסיר כמה שיותר קנה הנשימה גלוי ככל האפשר. קנה הנשימה עשוי כבר להכיל או להתמלא מאוחר יותר באוויר, מה שגורם למוחות לצוף, ופוטנציאלית, ללכת לאיבוד במהלך שלבים מאוחרים יותר של צביעת מערכת החיסון. כדי להסיר קנה נשימה, להרים אותו מהמוח באמצעות זוג חד מאוד של #5 מלקחיים.
- הסר את הרשתית הנותרת ואת הקוטיקולה שמסביב על ידי שימוש בשני זוגות המלקחיים כדי לתפוס את האזור המדיאלי של רשתית הזבוב השמאלית. בזהירות לקרוע את הרשתית לשניים כדי להסיר חתיכות של הרשתית ואת הקוטיקולה. במקרים מסוימים, הסרת הקוטיקולה הנותרת מבלי למחוץ את המוח מתגלה כמאתגרת במיוחד. במקרים אלה, מצאנו כי הגדילים הנותרים של חוט העצב הגחוני יכולים במקום זאת להיתפס על ידי זוג אחד של מלקחיים בעוד זוג השני של מלקחיים משמש בזהירות להסיר את האחרון של הקוטיקולה.
- באמצעות פיפטה p200, העבירו מוחות מנותחים לבאר אחת מתוך צלחת 9 או 3 בארות המכילה PTN. מוחות של אותו גנוטיפ צריכים להיות מאוחדים יחד באותה באר ולהישמר על קרח. רקמת המוח צריכה להיות קבועה בתוך שעה אחת של דיסקציה. ניתן לקבע מוחות בקבוצות קטנות ולאגד אותם אם נדרש מספר גדול יותר של מוחות. ברוב המקרים, חוקר מנוסה יכול בדרך כלל לנתח מוח ולהעביר אותו לצלחת איסוף הזכוכית בתוך כ 3 - 5 דקות.
