$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koyle et al., Reraising the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp.(2016).
1. הכנת כלובי הטלת ביצים
- הכינו צלחות אגר ממיץ ענבים על ידי מיקרוגל, 100 מ"ל מים, 10 גרם שמרי בירה, 10 גרם גלוקוז וגרם אחד של אגר. מביאים לרתיחה 3 פעמים בשלב 1.1 ומוסיפים 10 גרם של תרכיז מיץ ענבים קפוא כדי להגדיל את הנראות של ביצים על צלחת אגר.
- כאשר אגר התקרר ל 55 מעלות צלזיוס, יוצקים 20 מ"ל לתוך 100 מ"מ פטרי כלים ומניחים להתמצק.
- מכסים את פני השטח של צלחות אגר עם רסק שמרים על ידי ערבוב 1 גרם שמרי בירה עם 15 גרם מים. יוצקים משחת שמרים על צלחת האגר ומוודאים שהמשטח מכוסה, ואז יוצקים את העודפים, ומשאירים שאריות שמרים דקות מאחור. אם משתמשים במספר צלחות, ניתן לשפוך את העיסה ברצף למספר צלחות.
- מעבירים צלחות אגר לתחתית כלוב.
NOTE: מיכל מעדנייה במשקל 32 אונקיות הוא תחליף טוב לכלובי זבובים אקריליים.
- הכינו מכסים למיכלי מעדנייה במשקל 32 אונקיות על ידי חיתוך חור בחלק העליון והדבקת רשת נושמת מעל החור בדבק לא רעיל. אם הדבק מסיס במים, יש למנוע חשיפה למים למכסה.
- מעבירים 200-300 זבובים למיכל ומכסים במכסה. כסו את החור המוגן ברשת במכסה צלחת פטרי ריק כדי למנוע אידוי משטח האגר והוסיפו נייר טישו לח בתוך המכסה אם תרצו. דגירה טסה ב 25 מעלות צלזיוס לילה במשך 16-20 שעות.
2. לאסוף ביצים
- מכינים מסננת לאיסוף ביצים על ידי הנחת רשת ניילון לתוך שיח פלסטיק.
- כדי לאחזר את הצלחת עם ביצים עליה, הוציאו זבובים מהכלוב על ידי העברה למיכל ריק. אם ייעשה שימוש באותם זבובים למחרת, העבירו מיד לכלוב חדש המכיל צלחת אגר מיץ ענבים טרי ממיץ ענבים. ניתן להשתמש בזבובים במשך 3-5 ימים רצופים
- הסר זבובים מתים מהאגר עם מברשת צבע נקייה, היזהר לא לשבור את האגר.
- אספו ביצים על ידי שטיפת צלחת האגר במים מזוקקים, הברשה עדינה של ביצים משטח האגר ושפכו את הבוצה על הרשת. חזרו על הפעולה 3-4 פעמים עד שכל או רוב הביצים הוסרו מצלחת האגר.
3. ביצים dechorionate והעברה לתזונה סטרילית
- הכינו את ארון הבטיחות הביולוגית על ידי ריסוס החלק הפנימי (כולל הדפנות) באתנול 70%. נגבו את התחתית ברקמת מעבדה, ועיקרו את מכסה המנוע באור UV למשך ~15 דקות. יש לעקר את כל האספקה הלא ביולוגית (כוסות דגימה, מכחול, מלקחיים, מיכל פסולת, 400 מ"ל מים מעוקרים ו-100 מ"ל של 0.6% נתרן היפוכלוריט) על ידי ריסוס אתנול והכנסתם המיידית לארון הבטיחות הביולוגית. יש לעקר באור UV למשך 15 דקות.
- התחל את הראשון מבין 2 שטיפות hypochlorite נתרן על ידי הנחת bushing עם הביצים לתוך דגימה 120 מ"ל או מיכל סטרילי אחר. שפכו באיטיות ~90 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 0.6% לתוך השיח, עד ממש מתחת לשפה.
- שוטפים ביצים במשך 2.5 דקות. מעת לעת להשעות מחדש את הביצים באמצעות מלקחיים כדי להזיז את השיחים למעלה ולמטה בתמיסת היפוכלוריט.
- העבירו את התותב ישירות לכוס דגימה שנייה, ממולאת מראש באקונומיקה של 90 מ"ל, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
- חזור על שלב 3.3 בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. בסוף טיפול האקונומיקה השני, הביצים צריכות להתחיל להיצמד לצידי השיח.
- בצע את שלבים 3.7-3.8 בארון הבטיחות הביולוגית.
- השליכו את האקונומיקה ושטפו את השיח במים סטריליים 3 פעמים. השעו מחדש את הביצים מספר פעמים במהלך כל שטיפה על ידי הזזת השיחים עם מלקחיים. בסוף השטיפה השלישית רוב הביצים צריכות להיות מחוברות לצד השיח.
- בעזרת מברשת צבע מעוקרת באתנול, מעבירים ביצים מהצד של השיחים לתזונה סטרילית. מעבירים ביצים בנפרד או בקבוצות קטנות. יש לשאוף ל-30-50 ביצים בכל בקבוקון. השאירו את הפקקים רופפים כדי לאפשר לחמצן להיכנס לצינור.