$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koyle et al., Reraising the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. ביצים דכוריונטיות והעברה לתזונה סטרילית
- הכינו את ארון הבטיחות הביולוגית על ידי ריסוס החלק הפנימי (כולל הדפנות) באתנול 70%. נגבו את התחתית ברקמת מעבדה, ועיקרו את מכסה המנוע באור UV למשך ~15 דקות. יש לעקר את כל האספקה הלא ביולוגית (כוסות דגימה, מכחול, מלקחיים, מיכל פסולת, 400 מ"ל מים מעוקרים ו-100 מ"ל של 0.6% נתרן היפוכלוריט) על ידי ריסוס אתנול והכנסתם המיידית לארון הבטיחות הביולוגית. יש לעקר באור UV למשך 15 דקות.
- התחל את הראשון מבין 2 שטיפות hypochlorite נתרן על ידי הנחת bushing עם הביצים לתוך דגימה 120 מ"ל או מיכל סטרילי אחר. שפכו באיטיות ~90 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 0.6% לתוך השיח, עד ממש מתחת לשפה.
- שוטפים ביצים במשך 2.5 דקות. מעת לעת להשעות מחדש את הביצים באמצעות מלקחיים כדי להזיז את השיחים למעלה ולמטה בתמיסת היפוכלוריט.
- העבירו את התותב ישירות לכוס דגימה שנייה, ממולאת מראש באקונומיקה של 90 מ"ל, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
- חזור על שלב 1.3 בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. בסוף טיפול האקונומיקה השני, הביצים צריכות להתחיל להיצמד לצידי השיח.
- בצע שלבים 1.7-1.8 בארון הבטיחות הביולוגית.
- השליכו את האקונומיקה ושטפו את השיח במים סטריליים 3 פעמים. השעו מחדש את הביצים מספר פעמים במהלך כל שטיפה על ידי הזזת השיחים עם מלקחיים. בסוף השטיפה השלישית רוב הביצים צריכות להיות מחוברות לצד השיח.
- בעזרת מברשת צבע מעוקרת באתנול, מעבירים ביצים מהצד של השיחים לתזונה סטרילית. מעבירים ביצים בנפרד או בקבוצות קטנות. יש לשאוף ל-30-50 ביצים בכל בקבוקון. השאירו את הפקקים רופפים כדי לאפשר לחמצן להיכנס לצינור. אם הבקבוקונים יישארו אקסניים, העבר לאינקובטור חרקים; אחרת, הוסף חיידקים כמפורט להלן.
2. יצירת זבובים גנוטוביוטיים באמצעות 4 מיני חיידקים
- הכינו חיידקים
- הכינו ארון בטיחות ביולוגית מעוקר עם האספקה הדרושה (פיפטה, קופסאות קצה פיפטה, צינורות צנטריפוגות מעוקרות, ציר MRS ומתלים למבחנות) כמו בשלב 1.1. נגבו את החלק החיצוני של המבחנות במגבון מעבדה ספוג אתנול לפני הכנסתכם לארון הבטיחות הביולוגית.
- גלול את החיידקים על ידי העברת 500 μl של צמיחה בלילה לצינור microfuge סטרילי. אם צפיפות החיידקים נמוכה, הוסיפו עד 1.5 מ"ל לכל צינורית או הסירו ברצף סופרנאטנט והוסיפו תרבית נוספת לאותה צינורית. הסר דגימות מארון הבטיחות הביולוגית והצנטריפוגה למשך 10 דקות במהירות של 10,000 x גרם. השתמש בעצות מסנן כדי למנוע זיהום בין דגימות.
- קבע את הצפיפות של כל תרבות על-ידי מדידת OD600. אם אתם משתמשים בקורא צלחות רב-באר, העבירו 200 מיקרוליטר מכל תרבית לצלחת בעלת 96 בארות בדילול של פי 1, 2 ו-4.
- קבע את כמות mMRS שבה יש לדלל כל כדור תא (2.1.2) באמצעות ספקטרופוטומטר קריאת לוחות והמשוואות הבאות. תכננו להוסיף מספיק ציר כדי לחסן 50 מיקרוליטר לכל בקבוקון זבוב.
- אסוף קריאות OD600 לדילול 1:1, 1:2 ו-1:4 של כל תרבית חיידקים בספקטרופוטומטר קורא לוחות. בחר את הדילול עבור כל זן חיידק המפיק ערך OD600 בין 0.1 ל- 0.2 והשתמש בערך זה ובגורם הדילול המתאים לו כ- 'O' ו- 'D' בנוסחאות המפורטות ב- 2.1.4.2 או 2.1.4.3.
- אם משתמשים ב-4 המינים המתוארים כאן, נרמלו תאים לצפיפויות שוות ערך ליחידת יצירת מושבה (CFU)/ml (OD600 להמרת CFU שנקבעה קודם לכן ב-Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) באמצעות משוואה זו:
E = ((O-B) x V x D)/C
כאשר E = נפח להשעיית גלולה פנימה (μl), O = OD600 חיידקים, B = OD600 מדיה ריקה, D = דילול קיפול, V = μl תרבית חיידקים לפני צנטריפוגה, C = OD600 של קבוע קבוע מראש. ראה קובץ קוד משלים לקבלת דוגמאות לחישובים באמצעות משוואות אלה. עבור ספקטרופוטומטרים ריקים באופן אוטומטי, השתמש ב- "O" במקום "O-B".
NOTE: הקבועים שנקבעו מראש (יחידות OD600, מנורמל ל-107 CFU ml-1, קבועים הנגזרים ב-Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) הם כדלקמן: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
- אם אתה משתמש בזני חיידקים אחרים (אין קבוע CFU/OD600 זמין), נרמל את הצפיפות ל- OD600 = 0.1 באמצעות משוואה זו:
E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD600
NOTE: היחידות זהות לשלב 2.1.4.2. ראה קובץ קוד משלים לקבלת דוגמאות לחישובים באמצעות משוואות אלה.
- בארון הבטיחות הביולוגית, הסר סופרנאטנט עם קצה פיפט והשהה מחדש את הגלולה ב- mMRS טרי או PBS כפי שחושב בשלב 2.1.4.2.
- חיסון חיידקים
- מעבירים 50 μl של החיידקים לצינורות החרוטיים עם תזונה סטרילית וביצים dechorionated בארון בטיחות ביולוגית. הוסף חיידקים לאחר העברת ביצים כדי למנוע זיהום בין בקבוקונים.
- מניחים צינורות מחוסנים באינקובטור ב 25 °C.
3. מדידת עומס/בדיקת סטריליות של CFU
- כדי למדוד את עומס CFU בהומוגנאטים של זבובים בכל הגוף, העבירו 5 זבובים (5-7 ימים לאחר האקלוסיה) לצינור מיקרופוגה של 1.7 מ"ל המכיל 125 מיקרוליטר חרוזים קרמיים ו-125 מיקרוליטר מרק mMRS. הומוגניזציה עפה באמצעות הומוגנייזר רקמות למשך 30 שניות במהירות של 4.0 מטר לשנייה.
- לחלופין, השמיטו חרוזים וצרו הומוגניות ידנית בצינורות מיקרוצנטריפוגות עם מזיקים מפלסטיק למשך דקה אחת.
- אם מכמתים את מיקרוביוטת המעיים, מעקרים את הזבובים על פני השטח כדי לסלק מיקרובים אקסוגניים. מעבירים זבובים לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 100 μl 70% אתנול למשך דקה, שואפים אתנול ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש לצורך הומוגניזציה. אם תכולת הדנ"א של המעי תימדד, יש לשטוף במשך דקה אחת עם 0.6% נתרן היפוכלוריט לפני שטיפת אתנול.
- לדלל את ההומוגנאט עם 875 μl mMRS, מערבולת במשך 5 שניות, ו pipet 120 μl של הומוגנאט לתוך הבאר הראשונה של צלחת microtiter.
- בצע שני דילולים רציפים ביחס של 1:8 באמצעות 10 μl homogenate ו- 70 μl MRS בשתי הבארות הבאות.
- מוציאים 10 μl מהבאר הראשונה ומוסיפים אותה לבאר השנייה המכילה 70 μl MRS. מערבבים היטב את תכולת הבאר השנייה, מעבירים 10 μl מהבאר השנייה לבאר השלישית המכילה 70 μl MRS, ומערבבים היטב. זה מוביל ל-3 ריכוזים כוללים של 1,000 μl הומוגנט המקורי: לא מדולל, 1:8 ו-1:64.
- מעבירים 10 μl מכל דילול לצלחת mMRS (באמצעות צינור רב ערוצי אם רוצים). מטים מעט את התבשיל כדי לפזר את הדילול כמה מילימטרים במורד משטח האגר ומניחים לנוזל להתייבש לפני הזזת הצלחת. הנוזל מתייבש על הצלחת במהירות אם הצלחות בנות יומיים, ומפחית ערבוב של שתי טיפות שכנות.
- לדגור ב 30 ° C במשך 1-2 ימים. מוציאים צלחות מהאינקובטור ברגע שהן מובחנות, נראות מושבות בודדות, וסופרים מדילול עם 10-100 מושבות מבודדות.
- חשב CFU לכל זבוב באמצעות המשוואה E = C x D/P x V/F, כאשר E = CFU לכל זבוב, C = מספר המושבות שנספרו, D = דילול, P = μl מצופה, V = נפח הומוגנט הזבוב, ו- F = מספר הזבובים הומוגניים.