A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Guan, W., et al. דמיינו אקסונים של נוירון מוטורי רגל דרוזופילה דרך הקוטיקולה הבוגרת. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר שיטה לנתח, לתקן ולהרכיב את הרגל הבוגרת של דרוזופילה תוך שמירה על שלמותה העצבית-שרירית לצורך ניתוח הדמיה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).

1. דיסקציה וקיבוע רגליים

1. קח צלחת זכוכית רב באר ומלא מספר מתאים של בארות עם 70% אתנול. הוסיפו 15-20 זבובים מורדמים CO₂ (משני המינים ובכל גיל) לכל באר ובעזרת מברשת טבלו בעדינות את הזבובים בתמיסת האתנול עד שהזבובים שקועים במלואם.
   NOTE: שלב זה הוא להסיר את הידרופוביות של הקוטיקולה. אין לשטוף במשך יותר מ 1 דקה, כי זה מגביר auto-fluorescence של הקוטיקולה.
2. שטפו את הזבובים 3 פעמים בתמיסת חומר פעיל שטח לא יוני 0.3% במי מלח חוצצים פוספט (PBS). שמור את הזבובים בתמיסה זו לפחות 10 דקות.
   NOTE: הרגליים מקובעות טוב יותר כאשר הן כוללות חומר ניקוי, אשר עשוי להגביר את החדירה של הקיבוע בתוך הרגל.
3. הניחו צלחת מרובת בארות על הקרח יחד עם צינור של 4% פרפורמלדהיד (PFA).
   NOTE: הכנת 4% PFA טרי מתמיסת מלאי ללא אתנול 16% PFA היא קריטית.
4. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של הזבובים מבלי לפגוע בקטע החזה או ברגליים.
   NOTE: הסרת הבטן מקלה על אחיזת הזבוב וניתוח הרגליים.
5. לנתח את הרגליים מקטע החזה עם מלקחיים ומניחים את הרגליים בבארות המכילות 4% PFA. לשם כך, דחפו בעדינות אך בחוזקה בצומת קוקסה-בית החזה באמצעות קצה המלקחיים העדינים עד שהרגל מתנתקת.
6. יש לקבע את הרגליים ב-4% PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (כ-20 שעות בסך הכל).
7. שטפו את הרגליים בתמיסת חומר ניקוי פעילי שטח לא יוני 0.3% ב-PBS אחד, 5x למשך 20 דקות כל אחת.
8. החליפו את מאגר הכביסה באמצעי הרכבה. שמור את הרגל במצב בינוני לפחות יום לפני ההרכבה כדי לאפשר את חדירתה המלאה לרגל.
   NOTE: אם תווך ההרכבה צמיג מאוד, דללו את מדיום ההרכבה ל -80% עם PBS 1x מכיוון שהשינוי הפתאומי בצמיגות יכול לגרום לקוטיקולה לקרוס ולפגוע במבנה הכללי של הרגל. בהתאם לנהג Gal4, ניתן לשמר זבובים למשך שבוע עד שלושה שבועות בטמפרטורה של 4°C באמצעי הרכבה עד להרכבה.

2. הרכבה ברגל

הניחו כ-20 μL של 70% גליצרול בצד שמאל של מגלשת מיקרוסקופ וכסו בכיסוי ריבועי בגודל 22 x 22 מ”מ (איור 1 A,B).
1. פיפטה כ-10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לאורך קו מקביל לקצה הימני של כיסוי זה ובמרחק קטן ממנו. הוסף עוד 30 μL של אמצעי הרכבה בצד ימין של השקופית (איור 1C).
   NOTE: בעת החלת כיסוי על הרגליים (ראה להלן) אמצעי ההרכבה יתפשט בעדינות מתחת לכיסוי וסביב הרגליים מבלי להזיז אותן.
2. בעזרת מלקחיים עדינים מרימים את הרגל מהתמיסה ומניחים אותה בעדינות על אמצעי ההרכבה ליד הכיסוי השמאלי. עשו את אותו הדבר עבור כל רגל ויישרו אותה מלמעלה למטה (איור 1D).
   1. הרימו והעבירו את הרגליים בטיפת מדיום המוחזקת בין שני קצות המלקחיים. לכוון את הרגליים בשתי דרכים: צד חיצוני למעלה או למטה.
3. ברגע שכל הרגליים (עד 6-8 רגליים יכולות להיות מורשות) מיושרות כראוי, הניחו כיסוי שני מעל הרגליים כך שהכיסוי הזה יישען מעט על הכיסוי שהונח קודם לכן איור 1E כדי לאפשר רווח בין הכיסוי לרקמה ולמנוע פגיעה ברגליים (איור 1G).
   NOTE: לחלופין, השתמשו בבארות מדבקות או שעווה אורתודונטית כדי ליצור רווח בין הכיסוי למגלשה.
4. השתמשי בלק כדי לאבטח את מיקום הכיסויים בכל פינה (איור 1F).
   NOTE: הרקמה מוכנה כעת לצילום.

Representative Results

Materials

Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium