$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה מובא מתוך Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
הערה: ההליכים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. אינקובטורים מבוקרי טמפרטורה משמשים לשמירה על טמפרטורות לגידול זבובים וצלבים, אלא אם כן צוין אחרת.
1. הכנות
- הכינו זבובים.
- אוספי ביציות מועשרים בפרומטאפאזה.
- נקה זבובים בוגרים מזן בריא וצעיר או מתרבויות צולבות. בקבוקי גיל ליומיים ב 25 ° C.
NOTE: באופן כללי, שני בקבוקים בריאים יספיקו, אם כי ייתכן שיהיה צורך ביותר עבור תרבויות צולבות מסוימות.
- לאחר יומיים, אספו ~ 100 עד 300 נקבות (בנות 0 עד 2 ימים בשלב זה) מהבקבוקים. הנקבות לא צריכות להיות בתולות. הוסיפו מעט משחת שמרים לצד בקבוקון והכניסו 30 נקבות ו-10 עד 15 זכרים כל אחד לבקבוקוני השמרים. בקבוקוני גיל במשך יומיים ב 25 מעלות צלזיוס.
- אוספי ביציות מועשרים במטאפאזה.
- אספו ~ 100 עד 300 נקבות ממלאי או תרבויות צולבות. הוסיפו מעט משחת שמרים לצד בקבוקון והכניסו 30 נקבות כל אחת (ללא תוספת זכרים) לבקבוקוני השמרים. בקבוקוני גיל במשך שלושה עד חמישה ימים ב 25 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרונות.
NOTE: ניתן לאחסן תמיסות ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, אלא אם כן נאמר אחרת.
- הכינו את מאגר רוב שונה (5x): 500 מ"מ HEPES, 500 מ"מ סוכרוז, 275 מ"מ נתרן אצטט, 200 מ"מ אשלגן אצטט, 50 מ"מ גלוקוז, 6 מ"מ מגנזיום כלורי ו-5 מ"מ סידן כלורי. השתמש 10 N 11: 8 נתרן הידרוקסידי: אשלגן הידרוקסיד כדי להביא pH ל 7.4. עיקור על ידי סינון; אל תעשו אוטוקלאב. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. להפשיר לפי הצורך כדי להכין ~200 מ"ל של 1x רוב לכל הכנת ביצית.
- פתרונות קיבוע.
- אפשרות #1: הכינו קיבוע פורמלדהיד/הפטן. הכינו מאגר קיבוע: 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 150 mM סוכרוז. לשימוש, יש להכין טרי עם 687.5 μl Fixation Buffer ו-312.5 μl 16% formaldehyde per oocyte prep.
זהירות: יש ללבוש כפפות בעת השימוש בתמיסות פורמלדהיד במכסה אדים. יש להשליך פסולת בהתאם להנחיות המוסדיים.
- אפשרות #2: להכין קיבוע פורמלדהיד/קקודילט. הכינו תערובת פיקס: 250 מ"מ סוכרוז, 100 מ"מ אשלגן אצטט (pH 7.5), 25 מ"מ נתרן אצטט (pH 7.0) ו-25 מ"מ EGTA (pH 8.0). לשימוש, להכין טרי עם 400 μl Fix Mix, 100 μl אשלגן cacodylate (1 M, pH 7.2), ו 500 μl 16% formaldehyde לכל ביצית prep.
זהירות: אשלגן קקודילט מכיל ארסן.
- הכן PBS/Triton X-100: 1x PBS בתוספת 1% או 0.05% Triton X-100. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו אלבומין בסרום PBS-Tween 20-Bovine Serum (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (w/v) ו-0.1% Tween-20. ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע.
2. אוסף ביציות דרוזופילה בשלב מאוחר
- מכיוון שביציות דרוזופילה עם קרומים שלמים יידבקו לפלסטיק ולזכוכית, יש לצפות מראש את החלק הפנימי של צינור אחד של 5 מ"ל ופיפט פסטר אחד לכל הכנת ביצית ב-PTB.
- מרדימים את כל ~ 100 עד 300 זבובי שמרים עם פחמן דו חמצני ומוסיפים לבלנדר המכיל ~ 100 מ"ל 1x Robb's Buffer. דופק שלוש פעמים (~ 1 שניות כל אחת). שמור ביציות אצל רוב למשך <20 דקות כדי למנוע הפעלה.
NOTE: לחלופין, ניתן לנתח ביציות באופן ידני מנקבות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא דורשת פחות נקבות. עם זאת, יש להקפיד להגביל את החשיפה לפחמן דו חמצני למספר דקות בלבד, כדי למנוע ממצאים הקשורים להיפוקסיה.
- סנן דרך רשת גדולה (~ 1,500 מיקרומטר) לתוך 250 מ"ל כדי להסיר חלקי גוף גדולים. אם הרבה בטן שלמה נשארת על הרשת, טחנו מחדש את החומר באמצעות חיץ נוסף של רוב, וסננו שוב. תן לשקוע ~ 2 דקות, ואז לשאוף את השכבה העליונה, להסיר כמה שיותר חלקי גוף גדולים.
- סנן דרך רשת קטנה (~ 300 מיקרומטר) לתוך 250 מ"ל. שוטפים את הביציות הנותרות מהכוס הראשונה באמצעות פיפט פסטר נוסף של רוב ומצופה פסטר. תן להתיישב ~ 3 דקות; הביציות ישקעו. לשאוף את כולם מלבד ~ 10 מ"ל.
- יוצקים כמה שיותר מ-10 מ"ל לתוך צינור 5 מ"ל מצופה. הניחו לשקוע, הסירו את הנוזלים וחזרו על הפעולה עם השאריות. שטפו את הביציות הנותרות מהכוס באמצעות פיפט פסטר נוסף של רוב ומצופה פסטר. תן להתיישב 5 מ"ל צינור במשך ~ 3-5 דקות.
3. טיפולים תרופתיים (אופציונלי)
- יש לצפות צינורית שנייה של 5 מ"ל ב-PTB עבור כל הכנת ביצית. להוסיף ממס (בקרה) או תרופה מתאימים ל-1 מ"ל עבור כל אחד מכין ביצית (טבלה 1).
- פיצול הביציות לצינור 5 מ"ל מצופה שני. תן לשקוע, להסיר נוזלים, ולהוסיף 1 מ"ל רוב פלוס ממס לתוך צינור אחד 1 מ"ל של רוב פלוס תרופה לתוך צינור שני. נוטט למשך הזמן המתאים לטיפול תרופתי (טבלה 1). תנו להתיישב.
4. קיבוע
- יש לשאוף מכל הנוזלים ולהוסיף מיד 1 מ"ל תיקון.
- אפשרות #1: קיבוע פורמלדהיד/הפטן (חיץ קיבוע בתוספת 5% פורמלדהיד).
- תיקון במשך 2.5 דקות על nutator. מוסיפים 1 מ"ל הפטן ומערבולת 1 דקה. תן להתיישב ~ 1 דקות.
- הסר את כל הנוזלים, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל 1x PBS. מערבולת 30 שניות. תן להתיישב ~ 1 דקות.
- הסר את כל הנוזלים ולאחר מכן מלא את הצינור ב- 1x PBS.
NOTE: ניתן להשתמש בביציות באופן מיידי או לשמור על הנוטטור למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.
- אפשרות #2: קיבוע פורמלדהיד/קקודיל (Fix Mix בתוספת 8% פורמלדהיד ו-100 mM cacodylate).
- תקן במשך 6 דקות על nutator. תן להסתפק 2 דקות. הסר נוזל ולאחר מכן מלא את הצינור עם 1x PBS.
NOTE: ניתן להשתמש בביציות באופן מיידי או לשמור על הנוטטור למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.
5. הסרת ממברנות ("מתגלגל")
- באמצעות פיפט פסטר מצופה, הוסף ~ 500 עד 1,000 ביציות לחלק החלבי (התזת חול) של מגלשת זכוכית. יש להסיר את כל חלקי הגוף והחומר הזר באמצעות מלקחיים. אל תתנו לביציות להתייבש; הוסף 1x PBS לפי הצורך.
- הניחו כיסוי על גבי הביציות ו"גלגלו" בעדינות את הביציות עד להסרת כל הקרומים (גרירת קצה הכיסוי על פני הביציות עובדת בצורה הטובה ביותר). בדוק מעת לעת את ההתקדמות תחת המיקרוסקופ, והוסף עוד PBS 1x לפי הצורך. היזהרו מכיוון שלחץ רב מדי יהרוס את הביציות.