הסרה מכנית של קרום כוריון וויטלין: שיטה להכנת ביציות דרוזופילה להשגחה ישירה

תקציר

מקור: Perkins, A. T., Bickel, S. E. שימוש בהכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) כדי לפקח על מצב לכידות הזרוע בביציות דרוזופילה פרומטאפאזיות ומטה-פאזות I. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר שיטה להסרה מכנית של קרומי הכוריון והויטלין מביציות דרוזופילה בוגרות שהיו קבועות בעבר. הפרוטוקול המוצג מציג הדגמה מפורטת של ההליך המניב ביציות התואמות לבדיקות הכלאה פלואורסצנטיות באתרן.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Perkins and Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. הסרת כוריון וקרומי ויטלין

הערה: ראה איור 1 לקבלת הכלים הדרושים.

1. הפרדת ביציות בשלב מאוחר
   1. הוסיפו 1 מ"ל PBSBTx לצלחת ניתוח רדודה. השתמש P200 עם קצה מצופה BSA כדי להעביר שחלות קבועות (ב~ 150 μL) לתוך צלחת רדודה. שחלות פיפטה למעלה ולמטה עם קצה פיפטה מצופה BSA כדי לעקור את הביציות הבשלות מהביציות הפחות בשלות.
   2. כאשר הביציות בשלב מאוחר מופרדות מספיק, להעביר את כל הרקמה לצינור microfuge 500 μL. הסר נוזל עודף עם פיפטה פסטר משוך, משאיר על 150 - 200 μL בצינור. חזור על סעיף 1.1 עבור גנוטיפים שנותרו.
2. התכוננו לגלגול
   1. מרטיבים מראש צלחת באר עמוקה עם 200 μL של PBSBTx. מכסים ומניחים בצד. השג 3 שקופיות זכוכית חלבית והנח את השקופית #3 בצד. שפשפו בעדינות את אזורי הזכוכית החלבית של שקופיות #1 ו #2 יחד. שטפו אותם במים נטולי יונים, כדי להסיר שברי זכוכית וייבשו עם מגבון חד פעמי.
   2. צפה את האזורים החלביים של שקופיות #1 ו #2 עם PBSBTx על ידי הוספת 50 μL של PBSBTx לשקופית אחת ושפשוף אזור זה עם השקופית השנייה. מוציאים את הנוזלים עם מגבון חד פעמי.
   3. מקמו את השקופיות מתחת למיקרוסקופ מנתח בתצורה המוצגת באיור 2A. שמור את האזורים החלביים של שקופיות #1 ו- #2 במגע, כאשר שקופית #3 תומכת בשקופית #2.
3. גלגלו ביציות; ודאו שכיוון הגלגול הוא תמיד בקו ישר ולעולם לא בתנועה מעגלית.
   1. הרטיבו מראש קצה פיפטה P200 ב-PBSBTx ופזרו את הביציות בצינור המיקרופוגה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבר 50 μL של נוזל המכיל ביציות למרכז חלק זכוכית חלבית של שקופית #1. הרם מגלשה #2 כדי לעשות זאת.
   2. לאט להוריד להחליק #2 עד מתח הפנים של הנוזל יוצר אטימה בין שני אזורי זכוכית חלבית. צריך להיות מספיק נוזל כדי לכסות את האזור החלבי אבל אף אחד לא צריך לחלחל החוצה. אם הנוזל עולה על גדותיו, השתמשו בפיפטת פסטר משוכה כדי להסיר עודפי נוזלים.
   3. החזק את השקופית התחתונה (# 1) במקומה ביד אחת והשתמש ביד השנייה כדי להזיז את השקופית העליונה קדימה ואחורה בכיוון אופקי, תוך שמירה על רמת השקופית #2 ונתמכת בשקופית #3. בצע תחת מיקרוסקופ להדמיה קלה של תנועות הביציות והתקדמותן.
      NOTE: תנועה זו תיצור חיכוך ותגרום לביציות "להתגלגל" ולאבד את הכוריון שלהן. יש להשתמש בלחץ מינימלי והתנועות צריכות להיות קצרות ומהירות.
   4. לאחר מספר תנועות בכיוון האופקי, שנו מעט את זווית התנועה (איור 2B). בדרגות מרובות, הגדל בהדרגה זווית זו עד 90° עד שתנועת השקופית העליונה תהיה מאונכת לכיוון ההתחלה (איור 2B). שימו לב שכוריון ריק ייראה בנוזל וביציות חסרות כוריון ייראו ארוכות ודקיקות יותר.
   5. חזור על שלבים 1.3.3 - 1.3.4 בערך 7 - 10 פעמים עד שהתמיסה הופכת לעכורה מעט. הפסק להתגלגל כאשר נראה שרוב הביציות (75 - 85%) איבדו את קרומי הוויטלין שלהן.
      NOTE: קצה מחודד ייחודי נראה לעתים קרובות על ביציות חסרות קרומי ויטלין. קרום ויטלין קשה יותר להסרה מאשר כוריון. ניתן להפעיל לחץ קל על המגלשה העליונה (שקופית #2) בזמן הגלגול כדי להשיג הסרה של קרומי ויטלין. ניסיון להסיר קרומי ויטלין מכל הביציות גורם לעתים קרובות להרס של ביציות אחרות.
   6. בעדינות להרים את השקופית העליונה , גורר את אחת הפינות שלה למרכז האזור החלבי של השקופית התחתונה # 3, כך ביציות מגולגל להצטבר במרכז האזור חלבי. שטפו ביציות משתי המגלשות עם PBSBTx לתוך צלחת הבאר העמוקה המכילה PBSBTx.
   7. נקו שקופיות #1 ו #2 עם מים טהורים במיוחד, יבשו עם מגבון חד פעמי, ואיפסו. חזור על שלבים 1.3.1 - 1.3.6 עד שכל הביציות של אותו גנוטיפ גולגלו. זה בדרך כלל דורש 3 - 4 סיבובים של גלגול לכל גנוטיפ.
4. יש להסיר לכלוך לאחר הגלגול
   1. הוסף 1 מ"ל PBSBTx לצינור חרוטי 15 מ"ל. מערבלים את הנוזל כדי לצפות את דפנות הצינור.
   2. באמצעות קצה פיפטה P1000 מצופה PBSBTx, מעבירים את הביציות המגולגלות מצלחת הבאר העמוקה לצינור החרוטי המכיל 1 מ"ל PBSBTx. הוסף 2 מ"ל נוספים של PBSBTx לצינור החרוטי המכיל את הביציות.
   3. תן הביציות להתחיל לשקוע למטה, ולאחר מכן להסיר את 2 מ"ל העליון של תמיסה המכילה פסולת (chorions, vitellines, וכו ') עם P1000 ולהשליך. במידת הצורך, החזיקו את הצינור החרוטי על רקע כהה כדי לראות את הביציות האטומות בזמן שהן שוקעות.
   4. הוסף 2 מ"ל נוספים של PBSBTx לביציות, וחזור על שלב 1.4.3. חזור על 1.4.3. סה"כ 3 סבבים של פינוי פסולת.
   5. באמצעות קצה פיפטה P1000 מצופה PBSBTx, מעבירים ביציות חזרה לצינור המיקרופוגה המקורי של 500 μL. 20 - 25 נקבות אמורות להניב כ -50 מיקרוליטר של ביציות בוגרות מגולגלות.
5. חזור על סעיף 4 עבור שאר הגנוטיפים באמצעות שקופיות חלביות טריות, צלחת באר עמוקה ונקייה, וצינור חרוטי חדש לכל גנוטיפ.
6. אם יש צורך באחסון, העבירו ביציות ל-1x PBS עם 0.1% TritionX-100 ואחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ מכיוון שניתן להפוך את הקישור בין פורמלדהיד על ידי חומרי ניקוי לא יוניים.

תוצאות

איור 1: כלים ציטולוגיים. כלים המשמשים בפרוטוקול: (1) זוג מלקחיים (#5 Dumont); (2) מחט טונגסטן; (3) צלחת באר עמוקה עם כיסוי; (4) כלי ניתוח זכוכית רדודה; (5) משך פיפטה של פסטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר (BSA)	פישר סיינטיפיק	BP1600-100	הכן 10% מלאי הקפאת aliquots
10% טריטון X-100	תרמו סיינטיפיק	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
מלקחיים	דומונט		#5 INOX, ביולוגיה
פיפטות פסטר חד פעמיות מזכוכית בגודל 9 אינץ'	פישר	13-678-20ג	אוטוקלאבה לעיקור
צלחת ניתוח זכוכית רדודה			בהתאמה אישית
צלחת באר עמוקה (3 בארות)	פירקס	7223-34
מחט טונגסטן			תוצרת בית
שקופיות זכוכית חלבית, 25 x 75 מ"מ	VWR סיינטיפיק	48312-002
15 מ"ל צינורות חרוטיים	מגוון
צינורות מיקרופוגה 500 μl	מגוון
מגבונים	מגוון		מגבונים חד פעמיים