הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. שיטות לבדיקת בלוטת הלימפה וההמוציטים בזחלי דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2016).

המולימפה של דרוזופילה משמשת הן כדם והן כנוזל אינטרסטיציאלי, המסתובב בכל הגוף במהלך שלבי הזחל והבוגרים. סרטון זה מתאר פרוטוקול לאיסוף המולימפה של הזחלים על מנת לכמת את התאים במחזור.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Reimels and Pfleger, Methods to Examine the Lymph בלוטת והמוציטים בזחלי דרוזופילה, J. Vis. Exp.(2016).

1. ריכוז המוציטים במחזור

1. כדי להשיג זחלים בערך באותו שלב התפתחותי עבור בדיקה זו, להגביל את איסוף הביצים על ידי מתן אפשרות לנקבות להטיל ביצים לתקופה קבועה של 2 - 6 שעות.
2. אספו זחלים בבארות כלים מנתחות מלאות במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS).
3. עבור כל זחל, הניחו 10 μl 1x PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה על קרח ו-10 μl 1x PBS על משטח ניתוח נקי. הניחו את משטח הניתוח על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר.
4. יבש זחל בודד על ידי הנחתו על מגבון רקמות לפני העברתו לטיפת PBS על כרית הדיסקציה.
5. בעזרת זוג מלקחיים, קרעו בעדינות והפכו בזהירות את הקוטיקולה כדי לשחרר את ההמולימפה.
   NOTE: היזהר לא לגרד או לנגוח את הקוטיקולה כמו זה עלול לשחרר המוציטים sessile.
6. בעזרת פיפט, לאסוף את hemolymph מן כרית ניתוח. הימנעו מאיסוף פסולת זחלים כגון הגוף השמן.
7. מוסיפים את ההמולימפה לצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
   NOTE: ניתן לאסוף מספר דגימות בבת אחת ולשמור על קרח עד שעה.
8. אופציונלי: ערבבו את כחול טריפאן עם דגימת ההמולימפה בחלקים שווים כדי לצבוע ולא לכלול תאים מתים. ספרו תאים תוך 3 דקות מהוספת טריפאן כחול מכיוון שהוא רעיל לתאים.
9. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפני העמסת 10 μl לתוך תא המוציטומטר.
10. אם אתה משתמש במונה תאים אוטומטי, הגדר פרמטרים מתאימים עבור גודל התא והמעגליות. לדוגמה, הגדר גודל תא מינימלי של 2 מיקרומטר, גודל תא מרבי של 22 מיקרומטר, ומעגליות של 75 - 80% מעוגלות כדי לזהות המוציטים רגילים ועגולים. ניסוי עם פרמטרים שונים כדי לזהות המוציטים גדולים יותר בצורת ציר, כגון lamellocytes. לחלופין, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור המוציטים באופן ידני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טבליות PBS	MP Biomedicals	2810305
כלי ניתוח	קורנינג	7220-85
צינור מיקרוצנטריפוגה	דנוויל	C2170
משטח סיליקון לניתוח, עשוי מערכת Sylgard 184	Krayden (מופץ באמצעות פישר)	NC9644388 (מספר קטלוגי של פישר)	מיוצר בצלחת פטרי על ידי ערבוב רכיבים של ערכת אלסטומר Sylgard בהתאם להוראות היצרן.
סטריאומיקרוסקופ	Morrell Instruments (מפיץ Nikon)	mna42000, mma36300	דגמי Nikon SMZ1000 ו-SMZ645
מגבון רקמות	VWR	82003-820
מלקחיים	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72700-DZ
פיפטה P200	אפנדורף	3120000054
מונה תאים אוטומטי של הרוזנת	Invitrogen	C10227
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת	Invitrogen	C10283
המוציטומטר	האוזר סיינטיפיק	3200
כתם כחול טריפאן	לייף טכנולוגיות	T10282