דיסקציה של קומפלקס עין-מוח מגלמי זבובים: שיטה לבידוד רקמת רשתית

Abstract

מקור: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. דיסקציה של רשתית הגולם דרוזופילה לאימונוהיסטוכימיה, אנליזה מערבית ובידוד RNA. J. Vis. Exp.(2019).

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את קומפלקס עין-מוח מגלמי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המניב רקמות באיכות גבוהה, התואמות, למשל, immunostaining, כמו גם, ניסויים אחרים ביטוי גנים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך DeAngelis and Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. הכנת רקמות

1. הגדר צלבי דרוזופילה (כפי שתואר קודם לכן ב- Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) או זני דרוזופילה ספציפיים לתרבית כדי להשיג גלמים של הגנוטיפ הרצוי. כדי להבטיח שמספר גדול של גלמים יופיעו במקרה, ביססו את תרביות הזבובים הללו בשכפול על מצעי מזון עשירים בחומרים מזינים או על מצעי מזון סטנדרטיים בתוספת נדיבות של משחת שמרים.
2. שמור על תרביות דרוזופילה ב 25 ° C. עבור צלבים המשתמשים במערכת UAS-GAL4, GMR-GAL4 הוא מניע אידיאלי המתבטא בתאי דיסק של עין הזחל האחורי לתלם המורפוגנטי ולאורך התפתחות הגולם. הצלב UAS-lacZ X GMR-GAL4 משמש כצלב בקרה אידיאלי מכיוון שהוא מניע ביטוי של חלבון β-גלקטוזידאז לא אנדוגני ואינרטי.
3. השתמשו בקצה של סד במבוק בקוטר 6 אינץ' שנרטב במים מזוקקים כדי להרים בעדינות קדם-גלמים לבנים (איור 1B) מהצד של בקבוקוני תרבית בריאה (איור 1A) והכניסו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (איור 1C).
4. הכניסו את הצינורות לקופסת קצה פיפטה מפלסטיק יחד עם פיסת רקמה קטנה ספוגה במים מזוקקים כדי לשמור על התא בלחות מספקת כדי להגן על הגלמים מפני התייבשות (איור 1D). לדגור על הגלמים ב 25 ° C עד דיסקציה.
5. השתמשו בסד במבוק יבש בקוטר 6 אינץ' כדי לדחוף בעדינות את הגלמים החוצה מצינור המיקרוצנטריפוגה אל צלחת ניתוח שחורה. הניחו פיסת נייר דבק דו-צדדי טרי על צלחת הניתוח הרחק מהגלמים.
6. בעזרת זוג מלקחיים, הניחו בזהירות את הצד הגבי של הגלמים כלפי מעלה (כלומר, אופרקולומים הפונים כלפי מעלה, איור 1B) על הסרט (איור 2A). ודא כי הגלמים להיצמד היטב קלטת.
   NOTE: לחות על מארז הגולם תעכב היצמדות בטוחה לסרט הדבקה, ובמקרה כזה, תאפשר לגלמים להתייבש באוויר לפני הנחתם על הסרט הדו-צדדי.

2. דיסקציה של מתחמי עין-מוח

1. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את האופרקולום של כל גולם (איור 2C).
2. השתמש מספריים microdissection כדי לחתוך או לחתוך את מקרה הגלמים של כל גולם. פתחו את מארז הגולם כדי לחשוף את הראש, בית החזה ומקטע הבטן הקדמי, ואבטחו את קצוות מארז הגולם לסרט הדו-צדדי (איור 2C).
   NOTE: אין צורך לחשוף לחלוטין את הגלמים.
3. נקבו את בטנו של כל גולם בעזרת מלקחיים חדים, כדי לתפוס את החיה, והוציאו אותה ממארז הגלמים שלה (איור 2C).
4. הניחו את הגלמים על צלחת הדיסקציה השחורה, הרחק מסרט הדבק, וכסו בכ-400 מיקרוליטר של תמיסה חוצצת פוספט קרה כקרח (PBS, pH 7.4).
5. אחזו כל גולם בבטן בעזרת מלקחיים, ובעזרת מספריים מיקרודיסקציה, בצעו חתך רוחב נקי דרך כל בית החזה, וחתכו את הגלמים לשניים (איור 2D).
6. הסר את השארית האחורית של כל פגר מה- PBS ושים בצד אחד על צלחת הניתוח (אין להשליך, ראה שלב 3.2.1).
7. באמצעות שני זוגות של מלקחיים עדינים, פתחו את בית החזה והראש של כל גולם כדי לחשוף את קומפלקס עין-מוח (איור 2E). כדי לעשות זאת, לתפוס את הקצוות חתוכים של אפיתל בית החזה בהדרגה לקרוע כדי לפתוח את בית החזה ולאחר מכן ראש קמוסה, לחשוף את קומפלקס עין-מוח ואת רקמת השומן שמסביב.
8. מבלי לתפוס את הרקמה, השתמש במלקחיים כדי להנחות את קומפלקס העין-מוח הרחק משאריות קפסולת הראש או גרוף את קומפלקס עין-מוח מקפסולת הראש הפתוחה הקרועה.
   NOTE: קומפלקס עין-מוח הוא בצורת משקולת, אוף-ווייט, ושקוף יותר מהשומן בצבע קרם שמסביב (איור 2B,E).
9. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את רוב השומן הקשור למתחמי העין-מוח מבלי לגעת ברקמת העין.

3. עיבוד רקמה לאימונופלואורסנציה

1. יש לנתח לפחות 6-10 גלמים כמתואר (שלבים 2.1-2.9).
   NOTE: שלושה עד ארבעה שכפולים עצמאיים של כל דיסקציה נוטים להניב מספיק נתונים כדי לבחון השערה.
2. כביסה וקיבוע
   1. חתכו את קצה קצה פיפטה P20 או P100 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את פתח החוד ל~1 מ"מ ברדיוס ולשמן על ידי פיפטציה של תערובת של PBS ושומן למעלה ולמטה. שומן זה ניתן להשיג משאריות הפגר שהוסרו בשלב 2.6.
   2. מעבירים את קומפלקסי העין-מוח ל~400 מיקרוליטר של PBS בצלחת זכוכית של 9 בארות, על קרח. השתמש בקצה המשומן ובמיקרופיפטה תזוזת אוויר P20 או P100 כדי להעביר.
      NOTE: קומפלקסים של עין-מוח ידבקו בקצוות לא משומנים במהלך פיפטינג וייפגעו או יאבדו.
   3. הסר את שאריות השומן הקשורות לרקמת העין על ידי פיפטציה של PBS למעלה ולמטה כדי לערבל בעדינות את מתחמי עין-מוח. בצעד זה ובכל שלבי השטיפה הבאים, אין לבצע ישירות פיפטה של מתחמי עין-מוח למעלה ולמטה מכיוון שהדבר יפגע ברקמת העין השברירית.
   4. להעביר את מתחמי עין-מוח בנפח מינימלי (<20 μL) של PBS לתוך לפחות 250 μL של קיבוע. מערבבים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה. דגירה במשך 35 דקות, על ice.
      NOTE: ניתן להשתמש באותו קצה משומן שהוכן בשלב 3.1.1 להעברה זו.
   5. עם אותו קצה פיפטה, להעביר את מתחמי עין-מוח לתוך באר המכילה ~ 400 μL של PBS. מערבבים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה ודגרים במשך 5-10 דקות על קרח, לשטיפה. חזור על שלב הכביסה לפחות פעמיים.
      NOTE: מתחמי עין-מוח יכולים להישמר במשך מספר שעות בשטיפת PBS הסופית, על קרח, או ב -4 מעלות צלזיוס, לפני שתמשיך לשלב 3.3.1.
3. צביעת נוגדנים
   1. כדי לחסום את הרקמה לפני חשיפה לתמיסות נוגדנים, העבר את מתחמי העין-מוח ל~400 μL של PBT. השתמש בקצה המשומן ובמיקרופיפטה תזוזת אוויר P20 או P100 לצורך ההעברה. יש לדגור במשך 10 עד 60 דקות, על קרח.
   2. הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול נוגדנים מתאימים ב-PBT. מאז מתחמי עין-מוח מודגרים ב 10 μL aliquots של תמיסת נוגדנים, נפח מוכן יהיה העתק של 10.
   3. Aliquot 10 μL של תמיסת נוגדנים לתוך באר נקייה של מגש microwell 72-well.
   4. חתכו את קצה פיפטת P10 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את פתח החוד לרדיוס ~0.5 מ"מ ושימון על ידי פיפטינג PBT למעלה ולמטה.
   5. להעביר לא יותר מ 5 קומפלקסים עין-מוח, בנפח של <3 μL של PBS, לתוך כל באר 10 μL של תמיסת נוגדנים באמצעות מיקרופיפטה תזוזת אוויר P10 ואת קצה משומן.
   6. הומוגניזציה של תמיסת הנוגדנים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה. אין להקיף את מתחמי עין-מוח למעלה ולמטה כמו זה יפגע ברקמה.
   7. כדי למזער את האידוי של תמיסת הנוגדנים, הניחו פיסת רקמה קטנה ספוגה במים מזוקקים במגש המיקרווול ואטמו את המגש (למשל, עם המכסה שסופק). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
   8. העבירו את קומפלקסי העין-מוח ממגש המיקרווול ל~400 מיקרוליטר PBT בצלחת זכוכית בעלת 9 בארות, לשטיפה. השתמש במיקרופיפטה P10 לעקירת אוויר ובקצה משומן PBT (הכן כמתואר בשלב 3.3.4). מערבבים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה. דוגרים במשך 5-10 דקות על קרח.
   9. חזרו על שלב הכביסה לפחות פעמיים. השתמשו במיקרופיפטה של תזוזת אוויר P20 או P100 ובקצה משומן PBT כדי להעביר את קומפלקסי העין-מוח בין תמיסות שטיפה.
   10. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי דילול נוגדנים משניים מתאימים עם תווית פלואורופור ב-PBT לפי הצורך. 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית מספיקה לכל אצווה של 6-10 גלמים. Aliquot את תמיסת הנוגדנים המשנית לתוך צלחת דיסקציה זכוכית 9 בארות.
   11. העבר את מתחמי העין-מוח לתמיסת נוגדנים משנית. השתמש מיקרופיפטה תזוזת אוויר P20 או P100 וקצה משומן PBT עבור ההעברה.
   12. לדגור על מתחמי עין-מוח בתמיסת נוגדנים משנית במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר, או 3-5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. כדי למנוע הלבנה של פלואורופורים על ידי אור, לכסות את ההכנה עם נייר כסף.
       NOTE: משך הדגירה האופטימלי בתמיסת נוגדנים משנית עשוי להשתנות בהתאם לנוגדנים הראשוניים והמשניים המשמשים.
   13. העבירו את מתחמי העין-מוח ל~400 מיקרוליטר של PBT בצלחת זכוכית של 9 בארות, לשטיפה. מערבבים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה. דוגרים במשך 5-10 דקות על קרח. יש לחזור על שלב כביסה זה לפחות פעמיים.
4. קיבוע משני
   1. עבור קיבוע משני, להעביר את מתחמי עין-מוח לפחות 200 μL של קיבוע לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר או 35 דקות ב 4 ° C.
      NOTE: קיבוע משני מקשיח את רקמת העין, מה שמסייע להרכבה (שלב 3.5).
   2. השתמש במיקרופיפטה תזוזת אוויר P20 או P100 ובקצה משומן PBT כדי להעביר קומפלקסים של עיניים-מוח לתוך ~ 400 μL של PBT בצלחת זכוכית של 9 בארות, על קרח, לשטיפה במשך 5 דקות.
   3. חזרו על שלב הכביסה לפחות פעם אחת.
   4. השתמש במיקרופיפטה P20 או P100 לעקירת אוויר ובקצה משומן PBT כדי להעביר את קומפלקסי העין-מוח לתוך ~400 μL של PBS בצלחת זכוכית של 9 בארות, על קרח, כדי לשטוף במשך 1-2 דקות. שמור על הרקמה בתנועה על ידי pipetting PBS, אך לא את הרקמה, למעלה ולמטה כדי למנוע ממתחמי עין-מוח לשקוע ולהיצמד לצלחת הזכוכית במהלך PBS-שטיפה.
5. הרכבה
   1. העבר את מתחמי העין-מוח לתוך ~ 200 μL של מדיה הרכבה. השתמש במיקרופיפטה של תזוזת אוויר P20 או P100 ובקצה משומן PBT כדי להעביר את קומפלקסי העין-מוח. אפשר לרקמה להתאזן באמצעי הרכבה למשך 1-2 שעות.
   2. הניחו טיפה של 5-8 μL של אמצעי הרכבה טריים על שקופית מיקרוסקופ נקייה.
   3. חתכו קצה P10 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את פתח החוד ל~0.5 מ"מ ברדיוס והשתמשו במיקרופיפטה זו ובמיקרופיפטה תזוזת אוויר P10 כדי להעביר את קומפלקסי העין-מוח ב-5-8 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לתוך טיפת אמצעי ההרכבה בשקופית.
   4. השתמש בשתי מחטי טונגסטן כדי להפריד את העיניים מאונות אופטיות. הצמידו קומפלקס עין-מוח למגלשה בעזרת מחט טונגסטן חסונה וחתכו כל עין הרחק מהאונה האופטית הקשורה אליה בעזרת מחט טונגסטן עדינה (איור 2F).
   5. השתמש במחט הטונגסטן העדינה כדי לתמרן כל עין אל פני השטח של מגלשת המיקרוסקופ עם משטח הבסיס של כל עין צמוד למגלשה. מורידים בעדינות כיסוי נקי מעל הרקמה ומהדקים עם לק.
      NOTE: סידור העיניים בשקופית כך שיהיו קרובות זו לזו או בשורה יקל על המיקרוסקופ הבא.
   6. תמונה של הרשתית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית.
      NOTE: יש לאחסן שקופיות בטמפרטורה של 4°C אם לא ניתן לצלם אותן מיד.

Results

איור 1: ברירה ותרבות של גלמים לנתיחה. (A) זחלים וגלמים נודדים של זחל שלישי (L3) ממוקמים לאורך צידי תרביות דרוזופילה בריאות. (B) ניתן לזהות קדם-גלמים לפי צבעם הלבן השקוף, שכן פיגמנט טרם נוצר במקרה הגלמים המגן. הציר הקדמי-אחורי והגבי-גחוני של הגלמים מוצגים בכחול. סד במבוק לח משמש כדי לעקור ולקטוף גלמים מקדימים מדפנות הבקבוקון. (C) הגלמים ממוקמים בתוך צינורות מיקרו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סדים מבמבוק, 6 אינץ'	טד פלה בע"מ	116
צלחת ניתוח שחורה			צלחת פטרי מזכוכית ממולאת עד לשפה עם SYLG170 או SYLG184 (צבועה בשחור עם אבקת פחם טחונה דק). השאירו בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות כדי להתפלמר.
מחזיק להב	כלים מדעיים משובחים	10053
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A7906
סרט דו-צדדי	3 דקות	665
דרוזופילה ומדיה למזון, עשירה בחומרים מזינים			7.5% סוכרוז, 15% גלוקוז, 2.5% אגר, 20% שמרי בירה, 5% פפטון, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
דרוזופילה ומדיה למזון, סטנדרטית			בלומינגטון דרוזופילה סטוק מתכון קמח תירס. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
פתרון קיבוע			4% formadehyde ב PBS, pH 7.4.
מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	91150-20	להשחיז מלקחיים לעתים קרובות.
פורמלדהיד	תרמו סיינטיפיק	28908
זכוכית 9 בארות כלים	קורנינג	7220-85	ידוע גם בשם מנות 9-well
כיסויי זכוכית (22 x 22 מ"מ)	פישר סיינטיפיק	12-542-ב
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (25 x 75 x 1 מ"מ)	פישר סיינטיפיק	12-550-413
צלחת פטרי מזכוכית	קורנינג	3160-100BO
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516
צינורות מיקרוצנטריגורים	אקסיגן	MCT-175-C
מספריים מיקרודיסקציה	כלים מדעיים משובחים	15000-03
מגשי מיקרווול (72 x 10 מיקרוליטר בארות)	אנונימי	438733
מדיית הרכבה			0.5% N-פרופילגלאט ו-80% גליצרול ב-PBS
N-פרופילגלאט	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 3130
PBS (pH מלח חוצץ פוספט 7.4)	סיגמא-אולדריץ'	P5368	יש להכין בהתאם להוראות היצרן
PBT			0.15% TritonX ו-0.5% אלבומין בסרום בקר ב-PBS, pH 7.4
מחזיק סיכות	כלים מדעיים משובחים	26016-12
נוגדן ראשוני: עז anti-GAPDH	אימג'נקס	IMG-3073	לכתם מערבי. בשימוש ב- 1:3000
נוגדן ראשוני: ארנב נגד שסע Dcp-1	איתות סלולרי	9578S	עבור immunofluorescence. בשימוש בשעה 1:100
נוגדן ראשוני: חולדה נגד DEcad	מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה	DCAD2	עבור immunofluorescence. בשימוש ב- 1:20
נוגדן ראשוני: חולדה נגד DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	מתנה מטדאשי אומורה. משמש בשעה 1:100.
להבי אזמל	כלים מדעיים משובחים	10050	יש לנתק חתיכה קטנה של להב שעיר לעזאזל ולאבטח במחזיק להבים.
נוגדן משני: 488-מצומד חמור נגד חולדה IgG (H+L)	ג'קסון מחקר חיסוני	712-545-153	עבור immunofluorescence. בשימוש בשעה 1:200
נוגדן משני: cy3-conjugated עז נגד ארנב IgG (H+L)	ג'קסון מחקר חיסוני	111-165-144	עבור immunofluorescence. בשימוש בשעה 1:100
נוגדן משני: IgG נגד חולדות עז מצומדת HRP (H+L)	טכנולוגיית איתות תאי	7077	לכתם מערבי. בשימוש ב- 1:3000
נוגדן משני: ארנב מצומד HRP נגד עיזים IgG (H+L)	ג'קסון מחקר חיסוני	305-035-003	לכתם מערבי. בשימוש ב- 1:3000
מיקרוסקופ ניתוח סטריאו (M60 או M80)	לייקה מיקרוסיסטמס		או מיקרוסקופ דומה
סילגארד (שחור)	דאו קורנינג	SYLG170
סילגארד (שקוף)	דאו קורנינג	SYLG184	צבע שחור עם אבקת charcol טחונה דק
רקמות: מגבונים	קימטק	34120
טריטוןX	סיגמא-אולדריץ'	T8787
מחט טונגסטן, בסדר	כלים מדעיים משובחים	10130-10	הכנס למחזיק הפינים
מחט טונגסטן, חסונה	כלים מדעיים משובחים	10130-20	הכנס למחזיק הפינים
ממרח שמרים	(סופרמרקט מקומי)		כ-2 כפות שמרים ActiveDry של פליישמן (או דומים) מומסים ב~20 מ"ל H2O מזוקק