דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

תקציר

מקור: Kao, S. Y., et al. דיסקציה של Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (2019).

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. IFM דיסקציה לאחר 48 שעות APF

1. הרכיבו את הציוד הדרוש כולל שני מלקחיים #5 בדירוג ביולוגיה, מספריים עדינים, שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטיות, סרט מקל כפול, פיפטה, קצות פיפטה, קרח יבש, ומגיב בידוד (ליישומי RNA) (ראה טבלת חומרים). מצננים את צינורות PBS 1x ומיקרוצנטריפוגות על קרח.
2. בעזרת מברשת צבע רטובה קלות, העבירו את הגלמים המבוימים לרצועה של סרט דביק דו-צדדי המורכב על שקופית מיקרוסקופ (איור 1A). הניחו את הגלמים בשורה, בכיוון זהה (גחון כלפי מטה וקדמי כלפי תחתית המגלשה).
   NOTE: היזהרו לא להשתמש ביותר מדי מים על המברשת או הפילטר, אחרת הגלמים לא יידבקו היטב. אם הגלמים אינם נדבקים, יבשו אותם על ידי העברתם תחילה לפילטר יבש או לנייר טישו. הר גלמים רבים ככל שניתן לנתח בתוך חלון זמן של 30 דקות, באופן אידיאלי ~ 10 גלמים.
3. הסר את הגלמים ממארז הגולם. השתמשו במלקחיים כדי להפריד ולפתוח את מארז הגלמים מעל הספירקלים הקדמיים (איור 1B).
4. החליקו בעדינות זוג מלקחיים לכיוון האחורי, חתכו את מארז הגלמים בזמן שהמלקחיים נעים (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1B'). היזהר לא לקרוע את הגולם. שחררו את הגלמים מהמארז שנפתח והעבירו אותו מיד לטיפה של PBS 1x בשקופית מיקרוסקופ שנייה (איור 1B",C).
5. חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4 עבור כל הגלמים בשורה, ולאחר מכן הנח את שקופית הסרט הכפול בצד.
6. בעזרת המספריים העדינים, חתכו את בטנו של הגולם, הרחק מבית החזה ודחפו אותו לערימה נפרדת (איור 1D,D'). חזור על הפעולה עבור הגלמים הנותרים.
   NOTE: התחל לתזמן את משך הדיסקציה בשלב 1.6, ברגע ששלמות הגלמים משתבשת. נתחו כמה שיותר זבובים תוך 20-30 דקות כדי למנוע מוות תאי ושינויים שעתוק ופרוטאומי הקשורים אליו. כאשר מנתחים 1 d מבוגרים או >90 שעות גלמים, זה לעתים קרובות נוח עבור צעדים מאוחרים יותר כדי להסיר את הראש עם מספריים עדינים.
7. בעזרת נייר טישו, הסירו את רוב ה-PBS 1x (בדרך כלל מעונן עם שומן מרחף) וגם את ערימת הבטן (איור 1E). הוסיפו טיפה של PBS 1x טרי ומצונן לבית החזה הנותר.
8. השתמשו במספריים כדי לחתוך את בית החזה לשניים (איור 1F,F') על-ידי חיתוך מהראש במורד ציר הגוף האורכי בתנועה אחת. לחילופין, אם הראש הוסר, הכניסו תחילה את המספריים למקום אליו היה מחובר הראש וחתכו את החצי העליון של בית החזה לאורכו בין ה-IFMs. לאחר מכן, לחתוך את הצד הגחוני של בית החזה עם חתך שני באותו כיוון.
9. חזור על שלבים 1.7 ו- 1.8 כדי לנתח את כל הגלמים וליצור ערימה של חצאי בית החזה בסמוך למרכז המגלשה. ודא שיש מספיק PBS 1x מקורר על המגלשה כך שההמיסקציות לא יתייבשו.
   NOTE: לאחר APF של 48 שעות, IFMs גדולים מספיק כדי להיראות תחת מיקרוסקופ ניתוח סטנדרטי לעין מיומנת. בשלב זה של הפרוטוקול, ניתן להעביר שרירים עם תווית פלואורסצנטית לטווח ניתוח פלואורסצנטי כדי לסייע בזיהוי IFM או למטרות אימון, אך אין צורך בכך.
10. נתחו את ה-IFMs מחוץ לבית החזה. בודדו את אחד החצאים באמצעות מלקחיים #5 (איור 1G,H). הכניסו בעדינות את קצות המלקחיים מעל ומתחת לאמצע ה-IFMs (איור 1G',H'). בזמן שאתם מחזיקים את המלקחיים הראשונים ללא תנועה, השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך קצה אחד של ה-IFM הרחק מהציפורן והגידים. לאחר מכן, חתכו את הקצה השני של ה-IFM ללא הקוטיקולה (איור 1G'',H'').
    NOTE: בהתאם לכיוון בית החזה לאחר חיתוך IFM הראשון, כדאי לסובב את בית החזה 180° כך שחיתוך IFM השני יהיה קל יותר לביצוע.
11. הסר את צרור IFM מבית החזה בעזרת מלקחיים (איור 1G'',H'''), והעבר אותו לקצה בועת PBS כדי להשתמש במתח מים כדי להחזיק אותו במקומו (איור 1I). דחפו את הפגר לצד הנגדי של המגלשה. חזור על הפעולה עבור חצאי בית החזה הנותרים, ויצר אוסף של IFMs.
    מנותחים NOTE: אם ה- IFMs אינם נשארים בערימה מסודרת, הסר חלק מה- PBS 1x עם טישו. היזהר לא לתת לכל PBS להתאדות, וודא כי IFMs מנותחים hemithoraxes להישאר מכוסה על ידי חיץ.
12. לאחר ניתוח כל IFMs, לבצע במהירות בקרת איכות על השריר מנותח. באמצעות מלקחיים #5, הסירו כל שריר קפיצה או שברי ציפורן שאולי מצאו את דרכם לדגימה (איור 1J-K'').
    NOTE: שריר הקפיצה נראה שונה מ- IFM. אם מנתחים שריר מסומן Mef2-Gal4 תחת פלואורסצנטיות, שריר הקפיצה הוא בעל פלואורסצנטיות חלשה יותר וצורה ומרקם שונים. תחת אור רגיל, הוא נראה כמעט שקוף בעוד שה-IFMs הם צהוב חלבי אטום (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1J-J'',K).
13. באמצעות מתח מים, לכדו (אך אל תמעכו) את ה-IFMs המנותחים בין זוג מלקחיים (איור 1L). העבירו את ה-IFMs לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שמולא מראש ב-250 μL של PBS 1x מקורר (איור 1M). המשך מיד עם סעיף 2.
    NOTE: כאשר קצות המלקחיים מובאים זה לזה ומועלים מתמיסת חיץ, מתח המים גורם לבועת חיץ להילכד בין קצות המלקחיים. אם גם IFMs נמצאים בבועה זו, ניתן להרים אותם מהתמיסה ולהעבירם בקלות לכלי קיבול אחר מלא חיץ. חשוב לסחוט את המלקחיים כדי לקרב את הקצוות זה לזה מבלי לגעת זה בזה, כדי להימנע מפגיעה ברקמה שנלכדה בבועת החיץ.

2. גלולה ושימור דוגמת IFM

1. הטיל את ה-IFMs על-ידי צנטריפוגה של צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל למשך 3-5 דקות במהירות של 2,000 x גרם בצנטריפוגה שולחנית (איור 2A,B).
2. הסירו את המאגר באמצעות קצה פיפטה (איור 2C).
3. עבור יישומי RNA, השהה מחדש את כדורית IFM ב-50-100 μL של מאגר בידוד הרנ"א הרצוי (ראו טבלת חומרים, איור 2D). אחרת, המשך לשלב 2.4.
   NOTE: ניתן להקפיא יבש IFMs לאחר שלב 2.2 עבור תכשירים לספקטרומטריית מסות או בידוד של RNA באמצעות ערכות מסחריות (ראה תוצאות מייצגות). עבור יישומי RNA, תוצאות טובות יותר מתקבלות על ידי השהיה מחדש והקפאה מיידית של כדורית IFM במאגר בידוד.
4. יש להקפיא דגימה על קרח יבש או להקפיא בחנקן נוזלי (איור 2E). יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשלבים הבאים בהכנת הדגימה לניתוח במורד הזרם.
   NOTE: לאחר שימור בהקפאה, ניתן לאחסן דגימות במשך מספר חודשים לפני עיבודן לחקירה במורד הזרם.

תוצאות

איור 1: דיסקציה של IFMs לאחר APF של 48 שעות. (A) יישור הגלמים על נייר דבק כפול. (B) הוצאת הגלמים ממארז הגלמים על ידי פתיחה קדמית, חיתוך המארז גבי (B') והרמת הגלמים (B''). סמלי עיגול מיוצגים באופן זהה לאיור 2. (ג) העברת הגלמים לחיץ. (D) הסרת הבטן על ידי חיתוך במספריים (חיצים כפולים צהובים) והפרדה מבית החז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי תרבית 60 מ"מ	סיגמא-אולדריץ'	Z643084-600EA	צלחות גריינר, 60 מ"מ x 15 מ"מ, מאווררות
מצלמת טלפון סלולרי, Samsung Galaxy S9	סמסונג	SM-G960F/DS	משמש לתמונות שלא צולמו במיקרוסקופ
סרט הדבקה כפול	סקוטש/3M	3M ID 70005108587	סרט דו-צדדי, זמין ברוב המטפלים בציוד משרדי
Dumont #5 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11252-20	Inox קצה ישר 11 ס"מ מלקחיים, כיתה ביולוגיה עם 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ קצה
מצלמת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, מצלמת Leica DFC310 FX	לייקה		www.leica-microsystems.com
תוכנת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica Application Suite (LAS) גרסה 4.0.0	לייקה		www.leica-microsystems.com
מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica M165 FC	לייקה		www.leica-microsystems.com
טיסה: Bru1[M2]			מלאי זבובים; מאמר זה
טיסה: Bru1[M3]			מלאי זבובים; מאמר זה
לטוס: Mef2-GAL4	בלומינגטון סטוק סנטר	סאדו מאזו :27390	מלאי זבובים
זבוב: סלם[1]	בלומינגטון סטוק סנטר	3274	מלאי זבובים
זבוב: סלם[FRT]			מלאי זבוב; ראו Spletter et al., Elife, 2018
טיסה: UAS-Bru1IR	מרכז המחקר דרוזופילה וינה	GD41568	מלאי זבובים, סיכת ראש RNAi
לטוס: UAS-GFP::Gma	בלומינגטון סטוק סנטר	סאדו מאזו :31776	מלאי זבובים
לטוס: UAS-mCD8a::GFP	בלומינגטון סטוק סנטר	סאדו מאזן:5130	מלאי זבובים
זבוב: w[1118]	בלומינגטון סטוק סנטר	3605	מלאי זבובים
זבוב: weeP26			מלאי זבובים; ראו Clyne et al., Genetics, 2003
מגיב זיהוי GFP, GFP-Booster	כרומוטק	GBA488-100
גליקוגן	Invitrogen	10814-010
תוכנה לעיבוד תמונה, Photoshop CS6	אדובי		www.adobe.com
איזופרופנול	סיגמא-אולדריץ'	I9516-25ML	2-פרופנול
שיטה 1 (בידוד RNA): TRIzol	לייף טכנולוגיות	15596018	Guanidinium isothiocyanate ו פנול monophasic פתרון
שיטה 2 (בידוד RNA): שיטה 1 + ערכת טורבו ללא DNA	Invitrogen	AM1907	בידוד TRIzol ואחריו טיפול עם ערכה להסרת DNA
שיטה 3 (בידוד RNA): ערכת Direct-zol RNA Miniprep Plus	מחקר זימו	R2070S	בידוד RNA ב- TRIzol, אך מעל עמודות מסחריות במקום להשתמש בהפרדת פאזות. טיפול DNase מומלץ המבוצע עם Monarch Dnase I ב Monarch DNase I Reaction buffer.
שיטה 4 (בידוד RNA): ערכת מיני RNeasy Plus	קיאגן	74134	השתמשנו בטיפול DNase שסופק. כדורי IFM עברו הומוגניות בחיץ RTL כפי שהוצע לרקמות בעלי חיים.
שיטה 5 (בידוד RNA): מערכת Miniprep רקמת RNA ReliaPrep	פרומגה	Z6110	יישמנו את הפרוטוקול של 'טיהור RNA מרקמות סיביות'.
שיטה 6 (בידוד RNA): ערכת Monarch Total RNA Miniprep Kit	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	T2010G	יישמנו את הפרוטוקול עבור רקמות/לויקוציטים וביצענו ליזה ב-300 מיקרוליטר של מגיב הגנת RNA.
צינורות מיקרוצנטריפוגות	תרמו פישר	AM12400	צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל
שקופיות מיקרוסקופ	תרמו פישר	12342108	שקופיות סטנדרטיות, ללא טעינה, 1 מ"מ
מכחול	מאראבו	1910000000	Marabu Fino עגול מס' 0, או מברשת דומה מכל אספקת אמנות
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	158127
מאגר PBS (1x)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4417	טבליות מלח חוצצות פוספט לתמיסות 1 ליטר, pH 7.4
טיפים לפיפטות PureTip של PFA	מדעי היסוד	ES-7000-0101	תחליף אופציונלי לקצוות פיפטה סטנדרטיים להפחתת אובדן דגימה; 100 מ"ל, פתח 0.8 מ"מ
טיפים לפיפטה	סיגמא-אולדריץ'	P5161	אוניברסלי 200 מ"ל פיפטה טיפים
ריכוז RNA גישה 1 ועקבות שלמות RNA, Bioanalyzer	אג'ילנט טכנולוגיות	G2939BA
גישת ריכוז RNA 2, ננודרופ	תרמו פישר	ND-2000
ריכוז RNA גישה 3, קיוביט 4 פלואורומטר	Invitrogen	Q33238
RNase A	פרומגה	A7937
מים ללא RNase, דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)	סיגמא-אולדריץ'	D5758	DEPC לטפל במים במשך הלילה ולאחר מכן autoclave, כדי להסיר את כל RNase.
ערכת RT #1: ערכת תמלול הפוך Super Script III	Invitrogen	18080-044	ערכת תמלול לאחור
ערכת RT #2: LunaScript	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	E3010S	ערכת תמלול לאחור
ערכת RT #3: ערכת שעתוק לאחור QuantiNova	קיאגן	205410	ערכת תמלול לאחור
תוכנה סטטיסטית: GraphPad Prism	פריזמת GraphPad		www.graphpad.com
תוכנה סטטיסטית: Microscoft Excel	מיקרוסופט		נרכש כחלק מהחבילה: Office Home & Student 2019
צנטריפוגה שולחנית	אפנדורף	5405000760	צנטריפוגת אפנדורף 5425 או שווה ערך
רקמות/ מגבוני קימאו	סיגמא-אולדריץ'	Z188956	מגבוני רקמות סטנדרטיים
העברת פיפטה	סיגמא-אולדריץ'	Z350796	פיפטה מפלסטיק
מספריים קפיציים של Vannas	כלים מדעיים משובחים	15000-00	קצה חיתוך 3 מ"מ, קוטר קצה 0.05 מ"מ, אורך 8 ס"מ
נייר Whatman	סיגמא-אולדריץ'	1004-070	עיגולי נייר סינון, דרגה 4, 70 מ"מ