דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

תקציר

מקור: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).

1. הדמיית סידן In vivo

1. השתמש במיקרוסקופ מולטיפוטון המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים (ראה טבלת חומרים), המותקן על שולחן מבודד רטט. להדמיה של מחווני סידן מבוססי GFP, כוונן את הלייזר לאורך גל עירור של 920 ננומטר והתקן מסנן פס GFP.
2. בעזרת ידית הכוונון הגסה Z, סרקו דרך ציר Z במוח ואתרו את אזור העניין במוח. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה באזור זה בלבד כדי למזער את זמן הסריקה, ולסובב את תצוגת הסריקה כך שהחלק הקדמי של הראש פונה כלפי מטה.
3. התאם את גודל המסגרת ל- 512 x 512 פיקסלים, את מהירות הסריקה ל- >- 4 הרץ ואת אזור הסריקה (בממד Y) כך שהנוירונים המעניינים יהיו מכוסים.

2. הדמיה של מעברי סידן המעוררים ריח באמצעות מיזוג חוש הריח

1. השתמש במערכת העברת ריח שיכולה לספק מספר גירויי ריח באופן מדויק באופן זמני.
   1. השתמש במחשב נוסף כדי לשלוט במכשיר, ולתקשר עם תוכנת מיקרוסקופ ההדמיה כדי לתאם גירויי ריח עם לכידת תמונה במהלך ניסויים.
   2. הפעל חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר בין תוכנת רכישת התמונה לבין התוכנית להעברת ריח (לדוגמה, חבילת מאקרו VBA המותקנת בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, ראה טבלת חומרים) המגיבה לגורם מפעיל קלט חיצוני המסופק על-ידי הפעלת פרוטוקול העברת ריח בתוכנית נפרדת).
2. התחל את המדידה על ידי ניטור מעברי סידן "טרום אימון"/נאיביים המעוררים ריח ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וקצב פריימים של 4 הרץ. ספק גירוי ריח של 2.5 שניות ומשני צדדיו רכישת תמונה נוספת עבור 6.25 שניות לפני תחילת הריח (כדי לקבוע ערך בסיסי F₀) ו- 12.5 שניות לאחר היסט ריח. חזרו על הפעולה עם ריח שני ולאחר מכן עם ריח שלישי.
3. המשך 3 דקות לאחר מדידה זו עם התניה קלאסית ("אימון") הזבוב.
   1. בחר אחד מהריחות המוצגים בשלב "טרום האימון" כדי להפוך לריח CS⁺ ואחר שיהפוך לריח CS^. הצג את ריח CS⁺ באמצעות מערכת העברת ריח נשלטת מחשב למשך 60 שניות לצד שתים עשרה מכות חשמל של 90 וולט.
   2. לאחר הפסקה של 60 שניות, הציגו את ריח ה-CS בלבד במשך 60 שניות. השתמשו כריחות 4-מתילציקלוהקסנול ו-3-אוקטאנול. אין להציג את הריח השלישי (למשל, 1-אוקטן-3-ol) במהלך אימון זה, שכן הוא משמש כבקרה רק לפני (שלב 2.2) ואחרי (שלב 2.4) שלב האימון.
4. מדדו שוב את מעברי הסידן "שלאחר האימון" על ידי חזרה על פרוטוקול גירוי הריח "לפני האימון" (שלב 2.2.) 3 דקות לאחר סיום שלב האימון (שלב 2.3).
   NOTE: העיתוי של שלב זה צריך לשקף את זמן העניין לאחר היווצרות הזיכרון (למשל, בצע שלב זה 3-4 דקות לאחר שלב ההתניה כדי לחקור זיכרון לטווח קצר). בדרך כלל, זבובים יכולים לשרוד מספר שעות בהכנה זו.
5. שמרו קובצי הדמיה בתבנית מתאימה (לדוגמה, Tiff) לצורך ניתוח תמונה מאוחר יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-אוקטן-3-ol	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	O5284	כימיקל המשמש כחומר ריחני
3-אוקטאנול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	218405	כימיקל המשמש כחומר ריחני
4-מתילציקלוהקסנול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	153095	כימיקל המשמש כחומר ריחני
מסנן פסים עבור EGFP (525/50 ננומטר)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	M8410	משמש כמדלל לריחות
לייזר Ti-Sapphire נעול מצב Chameleon Vision 2	Coherent Inc., סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)		לייזר פמטו-שנייה אינפרא אדום
מיקרוסקופ מולטיפוטון LSM 7MP מצויד בגלאי BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה		מיקרוסקופ מולטיפוטון, חברות מרובות מספקות מכשירים דומים.
מטרת טבילה במים Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, גרמניה	421452-9900-000	מטרה W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
תוכנת Visual Basics of Applicatons (VBA) לקבלת טריגר מהמכשיר להעברת ריחות וממכשיר יישום ההתחשמלות (ספק כוח) לאינטראקציה עם תוכנת ZEN מבית Zeiss השולטת במיקרוסקופ	כתוב בהתאמה אישית וזמין לפי בקשה	נ.א.	נ.א.