פיצוח הקפאה של נמטודות: שיטה לחשיפת רקמות תולעים פנימיות להכתמה

תקציר

מקור: Zhang, N., et al. The C. elegans Intestine כמודל למורפוגנזה בין-תאית של לומן וביוגנזה של קרום מקוטב In Vivo ברמת התא היחיד: תיוג על ידי צביעת נוגדנים, ניתוח אובדן תפקוד RNAi והדמיה. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר פיצוח הקפאה, שיטה להנגשת רקמות C. elegans להכתמת נוגדנים על ידי שיבוש הקוטיקולה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Zhang et al, The C. elegans Intestine as a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

צביעת נוגדנים במעי C. elegans

1. קיבוע
   1. קחו מגלשת זכוכית נקייה והשתמשו בפולי-L-ליזין כדי ליצור סרט דק שתולעים יוכלו להידבק אליו. מניחים 30 μL 0.1-0.2% פולי-L-ליזין על המגלשה ומניחים שקופית שנייה על טיפת פולי-L-ליזין כדי להכין "כריך". לאחר מכן שפשפו את המגלשות בעדינות כמה פעמים כדי להרטיב את כל המשטחים של שניהם ותנו להם להתייבש באוויר במשך 30 דקות. תייגו את הצד החלבי של השקופיות בעיפרון.
      הערה: 0.2% פולי-L-ליזין aliquots של 200 μL נעשו על ידי המסת האבקה ב dH₂O; זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C. השתמש במשקל מולקולרי גבוה poly-L-lysine לשיפור הדבקה של התולעים. גם ריכוז הפולי-L-ליזין הוא קריטי. ריכוזים נמוכים מדי לא יאפשרו לתולעים להידבק, אך ריכוזים גבוהים מדי עלולים ליצור אות רקע פלואורסצנטי. סרט עבה מדי עלול להשתחרר בשלמותו.
   2. הניחו גוש מתכת שטוח בחוזקה על תחתית מיכל (למשל מיכל פוליסטירן) מלא בחנקן נוזלי.
      NOTE: אפשר להשתמש בקרח יבש במקום, אבל חנקן נוזלי שומר על גוש מתכת יציב יותר בתחתית המיכל ומצטנן היטב.
   3. אספו תולעים על ידי שטיפתן מהצלחת שלהן עם M9 או בחרו תולעי שלב שונות (ביצים, L1, L2, L3 או תולעי שלב הזחל L4) על כל שקופית. בדרך כלל, בחר ~ 100 זחלים ועוברים או ~ 20 מבוגרים לכל שקופית. יש להניח 10 μL שטף תולעים על אמצע המגלשה או לבחור ביצים / תולעים לתוך 10 μL M9 או 10 μL 1x PBS (פוספט חוצץ מלוחים).
      1. השתמש פיפטה כדי לפזר מספר גדול של תולעים כדי למנוע גושים.
         הערה: אוכלוסיות מעורבות של תולעים שנשטפו, בשל צפיפות ועובי שונה של שלבים, אינן נדבקות היטב והן פחות נסדקות בהקפאה (ראה להלן), ולכן קטיף תולעים ספציפיות לשלב (או אוכלוסיות מסונכרנות) נותן תוצאות טובות יותר. הזחלים נדבקים טוב יותר ממבוגרים וניתן להציב יותר בעלי חיים בכל מגלשה.
      2. לפני בחירת תולעים על שקופיות, העבירו אותן לצלחת Nematode Growth Medium (NGM) ללא חיידקי OP50. עודף חיידקים הדבקים בתולעים יכול גם להפריע להידבקות. שמור כי תולעים לא להתייבש.
   4. הניחו (שחררו) בעדינות כיסוי בקוטר 22 מ"מ × 22 מ"מ על גבי התולעים שנאספו, כך שקצותיו תלויים על צד אחד לפחות של המגלשה. לחץ ישר למטה בעדינות אך בחוזקה עם אצבע אחת או שתיים על הכיסוי. הימנעו מגזירה שתפגע בשלמות הרקמות.
   5. מעבירים מיד ובעדינות את המגלשה לגוש המתכת בחנקן נוזלי ומניחים לה לשבת כ-5 דקות להקפיא. לאחר מכן "העיף" את הכיסוי במהלך מהיר אחד באמצעות הקצה התלוי.
      NOTE: שלב זה חייב להיעשות בהחלטיות ובזמן שהשקופית קפואה כדי להשיג "פיצוח" של הקוטיקולה. אזהרה: יש לפעול בהתאם להנחיות PPE (ציוד הגנה אישי) בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
   6. טבלו את המגלשות הסדוקות בהקפאה בצנצנת קופלין מזכוכית מלאה מתנול למשך 5 דקות בטמפרטורה של -20°C. לאחר מכן מעבירים לצנצנת קופלין מזכוכית מלאה באצטון למשך 5 דקות נוספות בטמפרטורה של -20°C.
      NOTE: מתנול ואצטון יש לאחסן ב -20 ° C לפחות 30 דקות לפני השימוש. לאחר הקיבוע, שקופיות ניתן לאחסן ב -20 °C.
      זהירות: מתנול ואצטון רעילים.
   7. הסר את המגלשות מהצנצנת ותן להן להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.

חומרים