פרוטוקול זה מובא מתוך Teoh et al, גישות כמותיות לחקר מבנים תאיים ומורפולוגיה של אברונים ב- Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
הכנת שקופיות להדמיה
- הכינו 3-4% עם מלאי אגרוז בבקבוק בטוח למיקרוגל (3-4 גרם ב-100 מ"ל מים טהורים במיוחד).
NOTE: ניתן להשתמש באגר במקום אגרוז באותו ריכוז.
- ממיסים את האגרוז בזהירות במיקרוגל, נזהרים לא להרתיח יתר על המידה, עד שכל האגרוז מתמוסס (תמיסה ברורה). שמור את התמיסה בטמפרטורה של 70°C למניעת התמצקות.
NOTE: מלאי Agarose ניתן להשתמש מספר פעמים. יש לחמם מחדש לפני השימוש אם האגרוז התמצק.
- בעזרת פיפטה של פסטר מניחים טיפת אגרוז מומסת על שקופית מיקרוסקופ.
NOTE: הימנעו מבועות אוויר בטיפת אגר מכיוון שאלו משבשות את שלמות הפד.
- לחץ מיד על טיפת האגרוז עם מגלשת מיקרוסקופ נוספת, שטח בעדינות את האגרוז לכרית בין שתי המגלשות.
NOTE: כל שאריות הבועות יש להסיר בשלב זה. אם לא, יש להכין שקופיות חדשות מכיוון שבעלי חיים יכולים בקלות להיתקע בבועות. הימנע מהצפה של אגר הצידה בעת לחיצה על המגלשה.
- השאירו את האגרוז להתייבש למשך דקה.
- הפרידו בזהירות בין שתי המגלשות כדי למנוע נזק לאגרוז, תוך השארת הפד המוצק על אחת המגלשות.
NOTE: מגלשות עם רפידות אגרוז תמיד צריך להיות מוכן טרי ממש לפני הניסוי כפי שהם יכולים להתייבש. ודאו שלכרית האגרוז יש עובי עקבי. לא אמורות להיות בועות אוויר או סדקים בפד מכיוון שזה עלול להפריע להדמיה.
- הוסף טיפה קטנה (5-10 μL) של 0.05% tetramisole hydrochloride (הרדמה) למרכז כרית agarose.
- בעזרת פיק מעוקר בחום, מעבירים במהירות כ-10-15 בעלי חיים מצלחת המלאי לטיפת ההרדמה לפני שהתמיסה מתייבשת. הימנע מהעברת יותר מדי חיידקי OP50 מכיוון שזה הופך את התמיסה לעכורה, מה שעלול להפריע להדמיה.
NOTE: אם תמיסת ההרדמה מתייבשת בזמן הקטיף, פשוט מפיפטים טיפה שנייה של 0.05% טטרמיזול הידרוכלוריד על בעלי החיים. בעלי החיים נוטים לשכב על הצד הצידי שלהם בתמיסת ההרדמה.
- יש למרוח את הכיסוי על ידי הצבתו ממש מעל כרית האגרוז ולהפיל אותו בעדינות כלפי מטה. זה ימנע היווצרות של בועות. אין להפעיל לחץ על הכיסוי מכיוון שהדבר עלול למחוץ את בעלי החיים.
- תייג את השקופיות בשם המתח.